凝胶层析法
实验方法原理 | 葡聚糖凝胶SephadexG-200凝胶柱层析利用大分子不能进入凝胶颗粒内部最先流出柱外,而小分子物质进入凝胶颗粒内部,流速慢而最后流出柱外,将不同分子大小的物质分离开。(G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质)。 |
---|---|
实验材料 | PPO粗酶液 |
试剂、试剂盒 | Tris-HCL缓冲液 NaCL 聚已二醇 DEAE-纤维素DE52 |
仪器、耗材 | 试管 试管架 烧杯 玻璃搅棒 移液管 滴管 试剂瓶 层析柱 pH计 恒流泵 梯度混合仪 核酸蛋白监测仪 GL-20C高速冷冻离心机 DL-7A大容量低速冷冻离心机 |
实验步骤 |
葡糖糖凝胶过滤层析法 1.葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡 (1)柱材处理 称取一定量的SephadexG-200干粉,加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒,为防止凝胶颗粒中的空气存在,影响层析效果,凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉,其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中,进行抽真空处理,直到凝胶液中没有气泡出现为止。 (2)装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上,加1/3体积的无离子水,打开下出液口,水流畅通,即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液(凝胶的浓度过高会产生气泡,影响蛋白质分离速度,浓度过低易产生凝胶分层,影响蛋白质的分离效果)轻轻倒入层析柱中,凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部,凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处,停止装柱,剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵,下出液口连接蛋白质监测仪,待层析柱的平衡。 (3)平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡,所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液(洗脱液)置换出来,使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是:利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内,打开层析柱下端的出口,平衡液流速在0.5-1ml/min,当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时,层析柱达到了平衡。在本实验中,用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA),平衡SephadexG-200凝胶。 2.上样:将粗酶液上柱。 3.洗脱:用0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)洗脱,收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。 4.测定酶活性和蛋白质浓度。
展开 |
注意事项 |
0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml。
|
其他 |
调节PPO表达是未来研究热点.一方面因为受伤或衰老会导致黑色素的形成,负调节PPO能大量提高作物的质量。另一方面PPO的过度表达能减少害虫对作物的侵害,或通过影响植物蛋白形成抗营养机制,或在毛状体渗出液中通过它启动聚合作用捕获昆虫。因此负调节PP0表达或调节PPO使其过度表达在生产及应用方面都具有很好的前景及重要的实际意义。
|
记者从中国科学院长春应用化学研究所了解到,该所绿色分离化学与清洁冶金课题组在废旧动力锂电池分离回收新工艺上取得新突破。课题组负责人陈继介绍,我国动力锂电池生产、使用和出口均居世界前列。锂电回收和循环利......
介绍在抗体药物纯化工艺中,通常采用经典的三步或两步层析法,蛋白A(ProteinA)亲和介质(填料)因其配基上有多个区域对抗体Fc片段具有特异性吸附能力,因此广泛用于抗体捕获步骤(第一步层析)。通过一......
药物的分离纯化是从合成或天然来源中获得的药物混合物中,将目标化合物纯化为高纯度的过程。这是药物研发和制造过程中非常重要的步骤,因为高纯度的药物确保了其安全性和有效性。药物的分离纯化通常涉及以下一般步骤......
ÄKTA实验室级别层析系统是60多年蛋白质研究专业知识和30年纯化系统开发经验的结晶,一直专注于生物分子的纯化,致力于加速科学研究和工艺开发。而今,在应对各种分子的纯化挑战和加速工艺开发的基础上,Cy......
“玩了一辈子沙子”,这是艾捷博雅生物集团董事长汪群杰对自己的描述。从研究生、博士到博士后,汪群杰一直在做有机硅材料,入职安捷伦后开始接触色谱分离材料,在以硅材料为核心的分离材料上有深厚的沉淀。从安捷伦......
近日,中国科学院上海有机化学研究所质谱引导的SFC/UFPLC切换高通量自动纯化系统采购项目公开招标。项目编号:OITC-G220300352项目名称:中国科学院上海有机化学研究所质谱引导的SFC/U......
融胶液,可以使琼脂糖凝胶完全融化。同时采用了一种新型的离子交换柱,在特定条件下,使DNA能在离心过柱的瞬间,结合到DNA纯化柱上,在一定条件下又能将DNA充分洗脱,从而实现DNA的快速纯化。1.低熔点......
分析测试百科网讯近日,中国海洋大学采购蛋白纯化色谱系统、超高效液相色谱等设备,具体成交信息如下:中国海洋大学蛋白纯化色谱系统、超高效液相色谱等设备采购项目成交公告一、项目编号:HYHAQD2021-0......
分析测试百科网讯近日,中国海洋大学发布了多项公开招标公告,分别采购液相色谱/四极杆质谱联用仪、超高效液相色谱/单四极杆质谱联用仪、分析型高效液相色谱仪、全自动智能蛋白液相色谱系统、快速蛋白纯化系统、流......
PCR产物的直接纯化:一、原理PCR产物一般都含有过量的引物、TaqDNA酶及dNTP,这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程,因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多,商用......