氨基酸序列测定实验

分离胶和积层胶溶液 还原型谷胱甘肽干粉

4 × 凝胶缓冲液 10 × 下槽缓冲液 10 × 上槽缓冲液 甲醇 转移缓冲液 0.1%（V／V）考马斯亮蓝的 50％甲醇溶液 10％（V／V）乙酸的 50％甲醇溶液

微量注射器或凝胶加样吸头 PVDF 膜 小型电转装置 自动蛋白质测序仪

1. 如蛋白质电泳实验中所述，以分离胶和积层胶溶液灌制变性微型凝胶。在加入过硫酸铵和 TEMED 之前脱气，小心不要在转移或吸取液体时把空气带入聚合混合物中。如果加样孔不是矩形和结实的，则需重新灌制。

2. 组装垂直凝胶电泳装置。

3. 将 80 ml 4 × 凝胶缓冲液稀释至 320 ml（总浓度是 1 × 凝胶缓冲液）。将 200 ml 1 × 凝胶缓冲液倒入下层缓冲液槽。剩余的 1 × 凝胶缓冲液加入还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度 1 mmol/L，将它们倒入上层缓冲液储槽。

4. 将凝胶连接于恒压/恒流电源。每块胶 10 mA 预电泳 45 min。关闭电源，将凝胶放置过夜。

5. 倾出凝胶缓冲液，用纸巾或滤纸吸干加样孔。往下槽倒入 200 ml 1 × 下槽缓冲液。150 ml 1 × 上槽缓冲液加入 0.1 g 巯基乙酸，倒入上槽。

6. 将蛋白质样品溶于样品缓冲液，用微量注射器或凝胶加样吸头加样。对 0.75 mm 厚的 5 孔的微型凝胶每孔上样 < 30 μl。上样一已知蛋白质作为对照（如 β-乳球蛋白）。

7. 在 10 mA 下电泳至粉红色的示踪染料（焦宁 Y 染料，见辅助方案）达到凝胶的底部（60~80 min）。关闭电源。

8. 用甲醇润湿 2 张 PVDF 膜，然后浸没在转移缓冲液中。

9. 拆卸凝胶夹层，轻轻将玻璃板分开。按下面的次序在小型转移装置中组装转印夹层：塑料框、海绵、滤纸、凝胶、2 张 PVDF 膜、滤纸、海绵、塑料框（见图 10.6.1）。确保排除气泡。

10. 将转印夹层插入转移装置，最靠近阳极（红色或正极）的是膜。用转移缓冲液充满装置。在转移装置电极间的电压降为约 6 V/cm 的条件下（如 LKB 的 Midget MultiBlot，用 50 V），转移时间因目标蛋白和凝胶的浓度而异。关闭电源。

11. 拆卸转印装置，取出 PVDF 膜，将它浸没于含 0.1％ 考马斯亮蓝的 50％ 甲醇中，摇动 5 min。

12. 用含 10％ 乙酸的 50％ 甲醇脱色，摇动至条带变得清晰可见（5~10 min）。

13. 转印膜移入水中，拍照（可选，见 10.5）。

14. 用刀片将目标蛋白的条带切下（每条带均用新的刀片），将每一条带放入一个微量离心管中，室温风干（不要加热）。切下的条带储存于 -20℃。

15. 将切下的条带放入测序仪的反应室，蛋白质面朝向溶剂液流（或按厂商的说明）。在自动化测序仪中测序。

在特定的电压下，15%胶20～50 kDa蛋白质转移20～40 min；10%～12%胶50～100 kDa蛋白质 转移70 min；7%胶150～200 kDa蛋白质转移90 min。对>60kDa的蛋白质，减少转移缓冲液中 的甲醇量至1%。