神经细胞培养基质的预处理实验

几乎所有神经细胞的培养必须有大分子物质作为生长基质 ，细胞黏附其上才能生长 。 常用的有多聚赖氨酸 (polylysine ) 和多聚鸟氨酸 ( polyornithine) 。 此外还有 一些 细胞外 基质 ( ECM) 成分，如层黏连蛋白 (laminin) 、纤连蛋白 (fibronectin) 、胶原(collagen ) 等 。

神经细胞

培养液

培养瓶 恒温箱

1.多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸；

多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸是两种最常用的促进细胞贴壁生长的大分子。Polylysine或polyornithine均可从各种试剂公司订购，我室常用的是Poly-L-lysine hydrobromide (SigmaP6282),用pH值8.4的硼酸缓冲液或pH值7.4的PBS配成100µg/ml,过滤分装，-20℃保存。包被培养板时，我们一般选用25µg/ml的浓度进行包被，37℃4h或过夜，然后无菌水洗3遍（一定要将未结合的大分子洗去，因为他们都有细胞毒性），超净台中晾干。包被好的培养板和细胞瓶可在4℃保存2-4周，多聚赖氨酸可回收重复使用1-2次。

2.细胞外基质成分(ECMcomponents):

••••••••••••••••••••••••••••••••••••••细胞外基质成分是体内细胞间粘连和接触的最重要的参与物质，细胞外基质成分与细胞表面受体结合不仅调节细胞黏附，还直接调节细胞代谢、分化和基因表达。适用于在神经元培养尤其是外周神经系统神经元的培养。

胶原是动物体内最为丰富的蛋白，Ⅰ型纤维胶原很早就用于神经系统的组织培养，现在在外周神经系统的神经元和神经系统细胞系的培养中依然很常用 。Ⅰ型纤维胶原可以自己从鼠尾提取，现在也有很多商品化的产品可以购买 。 胶原包被时只需用很少最的溶液覆盖培养基质，放置于超净台中让水分自然挥发，自然凝固即可 。

纤连蛋白和层黏连蛋白是胶原之后另两种被用于神经细胞体外培养的两种细胞外基质成分 。 不同类型细胞对两种蛋白的敏感度不同，神经元大都在层黏连蛋白包被的基质上生长得更好 。 包被浓度为 10µg/ml 的层黏连蛋白 (Sigma L2020) 和 20µ,g/ml 的纤连蛋白 (Sigma F0635) 。

3. 神经干细胞的贴壁生长

神经干细胞 一般呈球形悬浮生长，如要贴壁培养，可预先采用 0 . 001 %多聚鸟氨酸和 0. 2% 明胶包被新的培养瓶，鸟氨酸包被过夜，明胶包被 4 -5h, 用时将明胶吸出，将神经球加进去，第 2天就可以观察到成球生长的神经于细胞已经单层生长 。

1.配置试剂的水质要有保证，最好使用超纯水，配液要精准。有条件的可以选择商品化的已配置好的试剂。

2.所有器皿、器械要洁净、干燥、无菌。不要用洗洁精清洗所用器皿，而且所有玻璃器皿都要过酸。我室现在使用一种新型清洁剂“迪康90",可生物递减分解，完全可清洗且不易燃烧，代替了铭酸混合清洁剂，保证工作人员的安全。

3.在无血清培养基中添加抗生素时，应至少降低有血清培养基中所使用浓度的50%。因为血清蛋白会结合和灭活一些抗生素，无血清培养条件下，抗生素不被灭活，浓度过高可能对细胞起到毒性水平。

4使用任何一种抗有丝分裂剂，都必须考虑其神经元毒性，应该确定最低效应的使用浓度。如阿糖胞苷在很低的浓度下，也会对某些种类的神经元有毒性，可以造成特定神经元的死亡。其他的抗有丝分裂剂尚未表现出这种毒性。

5.添加物和试剂不可反复冻融，尤其是含蛋白的试剂。如果冻融次数过多将会影响其生物活性。

6.配制消化酶溶液时应注意使用适当的溶液（不含Ca²⁺、Mg²⁺),调节至合适的酸碱度。用酶消化法解离细胞总的来说对细胞的损害程度较之机械分散法为轻，尤其是对于分化程度较高、形态不规整的细胞（如成年动物神经组织细胞）更如此。但是，用胰蛋白酶溶液过度消化细胞也会对细胞造成较大伤害。因此，必须注意控制酶植（酶浓度）、作用时间长短以及酶处理温度。

培养神经细胞实验心得：

1.选择培养基是细胞培养的基础和重要工作。这可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。本实验室常用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合于多种细胞。

2到底使用哪一种消化酶溶液，要根据拟解离组织的细胞外间质的具体构成成分而定。另外，在实际操作过程中，常会因组织的不同而需要联合使用几种消化酶。譬如，胰蛋白酶溶液与胶原酶溶液交替使用，胶原酶溶液与透明质酸酶联合使用等。更多情况下是将酶消化法与机械分离法结合使用以解离细胞。

3.自己清洗爬片时，最好将爬片放在大的平皿中，置于水平摇床上清洗，这样才能保证清洗干净。

4.在很多神经元的原代培养中，可使用联合包被的方法，多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸包被之后，再用层黏连蛋白或其他细胞外基质成分包被以达到最佳效果，大分子物质可促进细胞外基质成分同培养板的结合。

5.各种包被试剂的浓度、作用时间都有很多不同说法。不同实验室的体系不同，还需要实验人员自己摸索。虽然包被过的培养板可以在4°C保存一段时间，但培养一些比较特殊的神经元时最好还是现用现包