基本方案
实验材料 | 载体 |
---|---|
试剂、试剂盒 | 牛血清 DMEM 葡聚糖 PBS DMSO EDTA |
仪器、耗材 | 培养皿 培养箱 相差显微镜 离心机 |
实验步骤 |
1. 将目的基因亚克隆至合适的载体中得到所需的重组DNA,用小量法(5 ml 培养物)或用CsCl/溴化乙锭离心法纯化重组DNA。
4. 吸出COS细胞的培养液,向每一个100 mm 平血加入步骤3制备的DMEM-10 CS/DEAE-葡聚糖/DNA。在CO2培养箱中,37℃温育细胞3~4 h(可能需要优化),用相差显微镜观察细胞。
5. 吸出DMEM/DEAE-葡聚糖/DNA,加入5 ml 10%DMSO(用PBS配制),室温温育细胞2 min。吸出DMSO并加入10 ml DMEM-10 CS。让细胞在培养箱中于37℃ 生长过夜(12~20 h)。
7a. 当表达分泌蛋白时,在完成步骤6后96 h,加入5 ml DMEM-10CS并培养4天。收获培养液,室温下以约1 000 g 离心10 min,除去死细胞和碎片,保留上清液,用代谢标记、免疫沉淀、免疫亲和层折、放射免疫、免疫印迹或生物学鉴定来检测分泌蛋白质。
7b. 当表达细胞表面蛋白或细胞内蛋白时,按步骤5转染后72 h,从细胞中吸出培养液。加 入5 ml PBS,摇晃洗涤,吸出PBS。加入5 ml 溶于PBS中的0.5 mmol/l EDTA,在COS培养箱中37℃保温15 min。用巴斯德吸管轻轻移出培养皿中的细胞,采用合适的 荧光抗体使细胞表面蛋白染色,通过显微镜或流式细胞仪检测。
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