几种食品中的菌落检测方法评价

　　细菌总数测定是最常见的食品细菌污染指标之一，用来判定食品被细菌污染的程度，反映食品在生产、储存、运输、销售过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。其卫生学意义体现在：一方面是食品清洁状态的标志；另一方面可用作货架期评估，预测食品的耐保藏性。就定义而言，是指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的细菌菌落总数。

　　以菌落形成单位(colonyformingunit，CFU)表示。

　　最常用的细菌总数测定方法是菌落计数法(totalplatecount，TPC)。将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1ml置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下(一般为36±1℃)，培养一定时间后(一般为48h)，记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出原始样品中所含细菌菌落总数，以CFU／g(ml)报告。

　　TEMPO是一种新的以MPN(最大近似值)为计数原理的自动微生物定量检测仪，可用于多种微生物目标菌，包括细菌总数(totalviablecount，TVC)的测定。完整的TEMPO工作站由准备站和读卡站两部分组成，通过无线网络连接并即时传输数据。测定时，准备站部分进行样品的登录、稀释和填充，将一定浓度的样品稀释液加入定量的专用培养基后，通过充填箱将样品液充填至48孔测试卡后，经适当的培养(细菌总数测定要求37℃培养40h)，根据各孔道内细菌的生长状况，由读卡站进行荧光检测，自动读取结果并换算出样品中的目标菌数值，以CFU／g(ml)报告。

　　本文对这两种基于不同检测原理的食品中细菌总数的测定方法进行了比较。

　　1材料与方法1.1培养基和试剂缓冲蛋白胨水(BPW-D)；平板计数琼脂(standardmethodagar)。

　　1.2菌株枸橼酸杆菌(ATCC8090)、大肠杆菌(ATCC51813)、沙门氏菌(ATCC41912)、金黄色葡萄球菌(ATCC12600)、腊样芽孢杆菌(实验室存)等。

　　1.3常用微生物检验设备干热灭菌设备或湿热灭菌设备、培养箱36±1℃、刻度吸管(0.1ml或1ml，准确度±5%)、培养皿(直径90mm)、Bagmixer击拍器及样品袋、涡旋振荡器、定量分液瓶(1～5ml)、天平(感量为0.01g)。

　　1.4TEMPO微生物定量检测仪及TVC配套检测试剂TEMPO准备站(条形码扫描仪、样品充填箱及电脑)；TEMPO读卡站(条形码扫描仪、读卡箱、电脑及打印机)；TEMPO／TVC试剂盒(细菌计数用干粉培养基，48孔测试卡)。

　　1.5方法1.5.1菌落计数法［1，2］样品制备无菌操作取25g检样，放入225ml生理盐水中，击拍均质，即为1：10的样品匀液，再用生理盐水依次制成10倍递增稀释的样品液，如10-2、10-3、10-4……。

　　平板接种对一个样品，选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。分别用灭菌吸管吸取1ml样品液放入适宜标志的平皿内，每个稀释度用两个平皿。分别加12～15ml平板计数琼脂(已在45±1℃的水浴中恒温)到各平皿中。立即倾斜和旋转平皿，将其中的样品液和琼脂培养基充分混合。每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min.　　培养待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进36±1℃的恒温培养箱内培养48±2h.培养后，立即计数每个平板上的菌落数。25～250个菌落为合适范围。

　　计算和记录数字适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应的稀释倍数计算得出每g(ml)样品中的平板菌落数。

　　1.5.2TEMPO／TVC方法制样无菌操作取25g样品至样品袋中，加入225ml缓冲蛋白胨水(BPW)，击拍均质。向专用小瓶中加入3.0或3.9ml无菌水溶解干粉培养基。精确移取取1.0或0.1ml的样品稀释液加入3.0或3.9ml已溶解的专用培养基中，终体积为4ml(1.0ml样品液＋3ml培养为1：40稀释；0.1ml样品液＋3.9ml培养为1：400稀释)，充分混匀。通过TEMPO准备站电脑连接测试卡号和样品编号，通过充填箱将样品液充填至测试卡中。培养将测试卡插入培养／读卡架，37℃培养40h.

　　读卡在TEMPO读卡站由读卡箱通过光学方法自动读卡，由电脑对结果进行统计学分析，以CFU／g样品为单位显示检测结果。TEMPO的TVC(细菌总数)方法的计数范围为10至4900000个／g.

　　2结果与分析2.1标准菌株的添加实验将常见的食源性细菌枸橼酸杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和腊样芽孢杆菌分别制成10倍递增稀释的菌悬液，用TEMPO／TVC法和菌落计数法同时进行检测.

　　菌种ㄏlgTVC-lgTPCㄏa评价枸橼酸杆菌(ATCC8090)0.020～0.477(n＝4)无显著差异b大肠杆菌(ATCC51813)0～0.058(n＝4)无显著差异沙门氏菌(ATCC41912)0.099～0.699(n＝4)无显著差异金黄色葡萄球菌(ATCC12600)0.130～0.308(n＝5)无显著差异腊样芽孢杆菌(本实验室存保)0.046～0.221(n＝4)无显著差异注：a：lgTVC指TEMPO读数的对数值；lgTPC指按菌落计数的对数值。b：经t检验，p＞0.05，两种方法间无显著差异；反之则为有显著差异。

　　2.2自然样品的检测实验选取多个种类的190个食品样品，用TEMPO／TVC法与菌落计数法同时进行检测，结果见表2.

　　2.3两种方法对单一样品的重复测量的不确定度评定取冷冻水饺样品一份，取25g，放入225ml生理盐水中，击拍均质，再用生理盐水稀释为1：100的样品液，分别取10ml各用TEMPO／TVC法与菌落计数法进行10次重复测量，计算由散发引起的两种测量方法的不确定度。

　　3讨论国内外细菌总数测定的标准方法大同小异，绝大多数采用了菌落计数法。只在某些具体要求方面稍有差别，如有的标准方法在样品稀释和倾注培养时，特别对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等作了较具体的规定以确保精确性。不同的标准方法在平皿培养的温度和时间上或者在计数环节中选取的稀释度的计数有效值范围可能略有出入。目前我国对食品中细菌总数的测定方法主要是参照GB4789.

　　2-2003《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》或SN0168-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》，两者所采用的也均为此法。基本操作一般包括：样品的均质和稀释，倾注平皿，37℃培养48h和计数报告。作为传统的食品微生物检验方法，其结果具有权威性，但亦不能避免耗费时间和耗费人力较多的缺点。　　最大近似值(mostprobablenumber，MPN)计数又称稀释培养计数，是样品中活菌密度的估测。将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量(lm1)的样品液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大近似值”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。实际操作中，通常根据不同的目标菌的检测要求，可选择3～5个连续稀释度，每个稀释度重复接种3～10管，根据有细菌生长的管数检索相应的MPN值表，报告单位重量(或体积)的样品中细菌的MPN值。

　　在食品卫生检验方法中用到最多的是9管法，即取3个连续稀释度，每个稀释度接种3管。最大近似值法的优点是在细菌含量较低(＜100／g)时，以及测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群(如大肠菌群的数量)时尤其有用。缺点是结果是近似值而非绝对值，作为定量方法，在读取结果时需考虑95%的可信区间。

　　TEMPO／TVC法是一种新的基于MPN原理的仪器自动检测方法。其专用试剂盒提供了：①使细菌快速生长的培养基，内含复合荧光底物，细菌生长过程中，降解至少一种底物，可产生荧光信号；②48孔测试卡，包含了3种不同大小的独立孔道，相当于3个连续稀释度，每个稀释度重复16管。样品液充填后，经培养出现细菌生长的孔道会产生荧光，被读卡箱检测，根据阳性孔道的大小和数目(有／无荧光)由专门的数据处理软件计算原样本中的微生物数量，以CFU／g形式报告结果，计数范围主要有两种：10～49000CFU／g和100～490000CFU／g.与传统的MPN计数检验方法相比，单个稀释度的重复管数达16个，总管数达48个，还可根据用户需要将稀释度增加到6个，使总管数达96个，按统计学原理可见，TEMPO／TVC的精确度大大高于传统的9管法MPN值测定法；其二，TEMPO／TVC的结果是经换算的绝对计数值，单位为CFU／g，其结果与菌落计数法的结果可进行比较。

　　本文在对190个不同种类的自然样品的检测比较中，发现基于不同的检测原理，但TEMPO／TVC法与菌落计数法在检测结果上有较高的符合性。对计数范围

　　内的160个样品，将两种检验方法取得的数据进行回归分析，发现两者具有很高的相关性和一致性(y＝0.99x)，ㄏlgTVC-lgTPCㄏ＞1的样本仅有5个；而超过计数范围的30个样品结果均一致，即结果均小于10CFU／g或者均大于49000CFU／g或490000CFU／g.自然样品的总符合率达到97.4%。

　　本文选取了食品卫生经常涉及的革兰氏阳性细菌(包括1株产芽孢杆菌)和革兰氏阴性细菌作为添加试验的标准菌株，TEMPO／TVC法和菌落计数法的结果经t检验无差异，亦说明了TEMPO／TVC适应菌株的范围与菌落计数法一致。

　　读数因素是不确定度来源的一个重要分量，也是引起手工和自动化操作间结果差异的主要因素之一。菌落计数法测定细菌总数，是基于对平板上菌落的观察和计数结果，主要依赖操作人员的判断，因此总是会增加或降低检测结果的不确定度；而TEMPO／TVC法由仪器进行自动的读数，也会因固有设置而产生测量不确定度。本文对两种方法就单一样品重复测量的不确定度进行了评定。考虑到对相同样品，应用相同稀释度、稀释剂和培养温度，TEMPO／TVC法和菌落计数法在不确定度来源上的区别主要是读数，以及微生物检验的特点，本文主要对由散发引起的测量不确定度(A类不确定度)作了评定。结果TEMPO／TVC法和菌落计数法的不确定度(以取值区间表示)分别为1.5×104～3.3×104CFU／g和2.7×104～4.5×104C。