高效液相色谱如何工作？

一个储液瓶装有溶剂[称为流动相，因为溶剂是流动的]。一个高压泵[溶剂传输系统或称溶剂管理器]用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。一个进样器[样品管理器或自动进样器]可以将样品导入[注射]连续的流动相，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带[大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到]。流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。这种方法称为制备液相[在高效液相色谱量级中讨论]。注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。

　　高效液相色谱系统的各组成部分

检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。定性和定量样品内溶物浓度(如图F)。由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。例如，如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器[ELSD]。最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪[MS]联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质用.

高效液相色谱操作

一个简单的方法来理解如何获得样品中化合物的分离，如图G中简图所示。流动相从左侧进入色谱柱，流过颗粒层，再从右侧流出。绿色箭头代表流动方向。首先，上图表示在零时的色谱柱[进样时]，当样品进入色谱柱并开始形成一个谱带。这里显示的样品，是黄色、红色和蓝色染料的混合物，在进样口形成一条单一的黑色样品带。

[现实中，这个样品可以是任何能够溶解在溶剂中的物质；一般来说化合物是没有颜色的，色谱柱壁也不透明，所以我们需要一个检测器来查看洗脱出来的分离组分。]

几分钟后[下图],流动相连续并稳定通过填料层，我们可以看到不同的染料已经以不同的速度在分离开的谱带中移动。这是因为在流动相和固定相之间存在对每种染料或分析物的吸附竞争。留意黄色染料谱带移动最快，即将流出色谱柱。黄色染料比其他染料更喜欢[被吸附于]流动相。因此，它的流动速度较快，更为接近流动相的速度。蓝色染料谱带喜欢填料而不是流动相。它与填料颗粒有较强的吸附力使得它移动明显更慢。换句话说，它是这个混合样品中最强被保留的化合物。红色染料谱带对流动相吸引力一般，因此在色谱柱中的移动速度中等。由于每一种染料谱带移动速度不同，我们能够进行色谱分离。

　　Figure G: Understanding How a Chromatographic Column Works - Bands

什么是检测器?

当分开的染料谱带离开色谱柱后，它们马上进入检测器。检测器带有可以在流动相背景下看[检测]到每个分开的化合物谱带的流通池[如图H]。[实际上，在通常的高效液相色谱分析浓度下许多化合物的溶液都是无色的。]一个合适的检测器有能力辨别化合物的存在，并发送相应的信号到计算机数据站。正如前面谈到的，根据所需分离和分析的化合物的特性和浓度，可以在众多的检测器中选择其一。

什么是色谱图?

色谱图表示发生在高效液相色谱系统中的化学[色谱]分离。一系列从基线出现的峰以时间为坐标。每个峰代表对不同化合物的检测器反应。色谱图由计算机数据站描绘。[如图H].

　　Figure H: How Peaks Are Created

图H中，黄色谱带完全通过了检测器流通池；产生的电信号被送到计算机数据站。得到的色谱图逐渐出现在屏幕上。请注意从进样开始，色谱图就在屏幕底部形成直线。这条直线称为基线，它代表随时间变化，纯流动相通过流通池。随着黄色分析物谱带穿过流通池，一个较强信号被传送到计算机。这条曲线，开始是上升，之后下降，和样品谱带中的黄色染料的浓度成正比。这就形成了色谱峰。当黄色谱带完全流出检测器的流通池，信号强度回到基线水平，而流通池现在又一次，只有流动相。由于黄色谱带流动最快，首先从色谱柱洗脱出来，所以这是第一个峰。之后，一个红色谱带到达流通池。从红色谱带进入流通池开始，信号从基线抬起来，代表红色谱带的色谱峰被划出来。在本图中，红色谱带还没有完全通过流通池。图中所示是如果我们此刻停止该过程，红色谱带和红色色谱峰的样子。由于红色谱带的大部分已经通过了流通池，色谱峰的大部分已经被划出来，如实线所示。如果我们能再开始，红色谱带能完全通过流通池[虚线]。最强保留的蓝色谱带流速最低，在红色谱带之后流出。虚线表示如果我们连续完成，一个完整的色谱图如何出现。有意思的是蓝色峰的宽度将是最宽的，而蓝色分析物谱带的宽度在柱子上、是最窄的，而从柱中流出时变得最宽。这是因为它在色谱柱填料床中移动较慢，需要较多时间[和流动相体积]才被完全洗脱出来。由于流动相在一个固定的速度下移动，这意味着蓝色谱带展宽和变稀。由于检测器的反应与谱带的浓度成正比，因此蓝色峰高较低，而宽度较大。