阿霉素丙二醇脂质体的制备及体外抗肿瘤作用研究

化療作为癌症治疗的主要手段，存在两大问题：一是化疗药物缺乏选择性，二是多药耐药性[1-2]。靶向药物制剂成为当今抗肿瘤领域的研究主流[3-4]。高通透性和高滞留性[高渗透长滞留效应（EPR效应）]是肿瘤靶向药物设计的金标准[5]。醇质体是一种新型的柔性脂质体，是在脂质体的双分子层中加入不同的柔软剂，使脂质体膜具有较强的柔顺性和变形性，具有渗透性强的特点[6-7]。以丙二醇替代乙醇作为柔软剂，既保持了醇质体“可塑、柔韧、高渗透性”的优点，又克服了易挥发的缺点，从而使药物能够利用EPR效应被动靶向聚集在肿瘤间质[8-9]。泊洛沙姆是聚氧乙烯（PEO）-聚氧丙烯（PPO）-聚氧乙烯（PEO）的三嵌段共聚物。其中，PEO嵌段具有亲水性，而PPO嵌段具有疏水性，可根据聚合物分子中PEO和PPO的比例区别不同型号的泊洛沙姆。Ⅱ类泊洛沙姆能够最大程度地降低细胞膜微观黏度和耗竭细胞内腺苷三磷酸（ATP），抑制P-糖蛋白（P-gp）对阿霉素、紫杉醇等药物的外排[10-13]。

本研究将泊洛沙姆逆转肿瘤多药耐药的聚合物疗法与纳米级载药丙二醇脂质体技术相结合，制备多功能阿霉素丙二醇脂质体（A-PL），提高肿瘤组织对化疗药物的吸收并降低其产生耐药性，以期探索出一种提高肿瘤化疗效率和安全性的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

透射电镜（JEM-2100F，日本电子株式会社）、激光粒度分析仪（Mastersizer 2000，英国马尔文仪器有限公司）、倒置荧光显微镜（Nikon eclipse TS100，日本Nikon）、全自动酶标仪（SpectraMax M2/M2e，美国Bio-Rad公司）、CO2恒温细胞培养箱（M2300，美国Sheldon公司）、Zeta电位测定仪（马尔文，北京东方安诺生化科技有限公司）。

1.2 试药

人肝癌细胞HepG-2细胞由温州医科大学药学院提供。6孔、96孔细胞培养板（美国Costar原装）、大豆卵磷脂E200（批号：139060，上海艾韦特医药科技有限公司）、泊洛沙姆188（批号：WPAK524B，BASF公司）、胆固醇（批号：CC25151602，上海艾韦特医药科技有限公司）、吐温-80（批号：50116，天津市光复精细化工研究所）、盐酸阿霉素（浙江海正药业股份有限公司）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，批号：AC10260338，Hyclone）、MTT试剂盒（批号：01191818 0508，上海碧云天生物技术有限公司）、胎牛血清（批号：1428478，Gibco公司）、RPM1640培养液（批号：8115111，GIBCO公司）、0.25%胰蛋白酶消化液（批號：1869505，GIBCO公司）、二甲基亚砜（批号：1213C025，Solarbio公司）、1，2-丙二醇（批号：74697305，上海迈瑞尔化学技术有限公司）、柠檬酸钠（批号：F20110114，上海沪试实验室器材股份有限公司）、无水海藻糖（20160711，上海沃凯生物技术有限公司）、罗丹明123（Rh123）试剂（批号：R8004，sigma公司）。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 阿霉素丙二醇脂质体的制备  精密称取阿霉素（ADR）24 mg、大豆卵磷脂 40 mg、胆固醇20 mg、吐温-80 2 mg、柠檬酸钠5 mg、泊洛沙姆188 20 mg加入到2 mL丙二醇（丙二醇∶5%海藻糖=1∶5）中，60℃水浴溶解。将溶解后的丙二醇溶液缓慢加入到10 mL含有5%海藻糖溶液中，750 r/min旋转30 min，再分别经0.8、0.65、0.45、0.3、0.22 μm微孔滤膜过滤，即得A-PL，浓度为2 mg/mL[14]。

2.1.2 粒径与Zata电位检测  取制备好的A-PL溶液，纯水稀释10倍后用激光粒度分析仪和Zeta电位分析仪分别测定脂质体粒径大小和Zeta电位。

2.1.3 包封率和载药量检测  采用超速离心法分离未包封的游离药物，HPLC高效液相法检测药物含量。色谱条件为：色谱柱KrusamA-PL C18（4.5 nm×250 nm，5 μm），保护柱：Agilent XDB-C18（4.5 mm×12.5 mm，5 μm），流动相为甲醇-1%冰醋酸（30∶70），柱温室温，UV检测吸收波长为230 nm，流速为l mL/min。计算公式为：包封率=（药物投料量-游离的药物量）/药物投料量×100%;载药量=脂质体中药物量/（脂质体中药物+载体总量）×100%

2.1.4 细胞毒性检测  将HepG-2细胞种植在96孔板上（5×103个/孔）。孵育24 h后，每孔板分别加入空白乙醇脂质体和空白丙二醇脂质体，比较不同载体浓度对细胞存活率的影响。再取24孔板，分别加入不同浓度的A-PL和ADR溶液，并设立对照组（空白对照与阴性对照）。每组设5个浓度，分别为1、5、10、50、100 μg/mL。孵育12 h后，移去药液并加入新鲜培养基及MTT溶液10 μL（5 mg/mL），培养4 h，加入100 μL二甲基亚砜，振摇均匀，酶联免疫法测定570 nm处的吸光度并计算细胞存活率。

2.1.5 HepG-2对A-PL的摄取检测  将HepG-2细胞种接种在6孔板上，过夜。每孔板分别加入5个浓度的A-PL和ADR溶液，分别为1、5、10、50、100 μg/mL。孵育15 min后制备细胞悬液（0.5 mL/管）于流式管中检测。

2.1.6 HepG-2对阿霉素丙二醇脂质体的促摄取机制  将HepG-2细胞种植在6孔板上过夜。每孔板加入50 μg/mL A-PL，分别孵育2、6、12、24 h后移去药液并用冰PBS冲洗干净，于倒置荧光显微镜观察。

2.1.7 P-gp功能检测  选用环保菌素A（CsA）为阳性对照药物，其主要作用机制为抑制P-gp功能。将HepG-2细胞接种于6孔板过夜，密度为1×106个/mL。实验分组设计：组1（阴性对照组）：Rh123;组2：Rh123+ADR;组3：Rh123+A-PL;组4（阳性对照组）：Rh123+CsA。

2.1.8 统计学方法  采用SAS 8.01统计学软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用Newman-Keuls检验，组内比较用Student′s t-test，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2.2 结果

2.2.1 阿霉素丙二醇脂质体表征  A-PL微观形态结构圆整，且具有明显的磷脂双分子层，部分醇脂体形成多层脂质体结构，粒径在150 nm左右（图1）。图2所示测得的粒径为164 nm，多分散指数（PDI）为0.145，粒径对称分布，单分散性较好，略大于透射电镜结果，符合预期。Zata电位为-5.78 mV，粒径对称分布，弹性值>40。结果表明制备的A-PL形态好，粒径小，具有良好的柔韧性和可塑性。

2.2.2 包封率和载药量  评价脂质体物理性质的重要指标包括包封率和载药量。20 000 r/min离心15 min后检测制备的A-PL包封率为83.7%，符合2015版《中华人民共和国药典》规定。

2.2.3 细胞毒性  细胞毒性大小影响着细胞生理活动，脂质体是造成细胞毒性的根本原因[15-16]。当载体浓度<25%，细胞存活率均>90%，而細胞存活率随乙醇脂质体的载体浓度的增加而显著下降;当载体浓度>25%，丙二醇脂质体组细胞存活率显著降低，乙醇脂质体组细胞存活率<10%（图3）。提示丙二醇脂质体较传统的乙醇脂质体具有更好的细胞安全性。载体浓度均<25%，可不考虑空白丙二醇脂质体对细胞的影响。

本研究还比较了A-PL与ADR溶液对细胞存活率的影响。随ADR浓度增加，HepG-2细胞存活率与药物剂量存在相关性;在同等浓度下，A-PL的细胞抑制率较高（图4）。提示本研究制备的A-PL由于其特殊优势保持并提高了ADR的抗肿瘤活性。

2.2.4 阿霉素丙二醇脂质体促细胞药物摄取  细胞内药物摄取呈剂量依赖性;随着浓度增大，A-PL组与溶液组均向右位移;但无论在低浓度还是高浓度条件下，A-PL组的位移距离大于溶液组（图5）。提示丙二醇脂质体可增强HepG-2细胞对ADR的摄取，有利于药物富集于靶细胞，并且发挥药效。

随着A-PL作用时间延长，细胞形态随之发生改变。作用2 h时HepG-2形态基本保持梭形;24 h后，细胞数量稀少，形态变圆形，并且可以看到细胞核中的荧光强度更大，提示A-PL具有良好的细胞毒性，粒径小，制剂中加入的丙二醇增强了渗透性，使其与细胞核更具亲和性。见图6（封四）。

2.2.5 P-gp功能检测  细胞内的Rh123累积量与剂量相关。与阴性对照组（组1）比较，ADR浓度<5 μg/mL时，ADR溶液处理（组2）的细胞内Rh123累积量无明显变化;A-PL处理（组3）的细胞内Rh123累积量显著较高（P < 0.05）。与阳性对照组（组4）比较，当ADR浓度>50 μg/mL时，ADR处理（组2）和A-PL处理（组3）的细胞内Rh123累积量差异无统计学意义（P > 0.05）。见图7。这说明A-PL克服肿瘤耐药性并不只是依赖内吞作用，其还能抑制P-gp对ADR的外排。

3 讨论

本研究基于已有丙二醇脂质体制备方法基础上，继续优化处方工艺，用丙二醇代替传统的乙醇等溶剂，并加入一定浓度泊洛沙姆，制备出新型的A-PL。外源性物质除通过细胞膜上的微型孔道或者自由扩散的方式进入细胞浆外，还可以通过内吞进入[17-18]。丙二醇是一种良好的促渗剂，能增加脂质体的弹性，使细胞脂质膜由胶晶态转变为液晶态，增加细胞膜的流动性和细胞表面的孔道，有利于脂质体进入细胞[19]。荧光显微镜下观察药物摄取结果提示，ADR溶液主要以扩散的方式进入细胞，而本研究制备的A-PL则主要以内吞方式进入细胞核。

本研究结果表明，基于丙二醇特性，使得A-PL更易进入细胞，且与细胞有较强的亲核性。泊洛沙姆逆转肿瘤多药耐药性的机制为：游离的PPO嵌段会插入生物膜的脂溶性区域，扰乱了生物膜的结构，进而改变其流动性[20-21]。同时，本研究结果显示含泊洛沙姆的脂质体可以显著抑制P-gp对ADR的外排。

综上所述，A-PL不仅可以降低阿霉素的本身毒性，还可减少药物用量，克服肿瘤耐药性，提高抗肿瘤效果。其作用机制主要包括：①由于其具有高渗透性和滞留性，即高EPR效应，其通过内吞进入细胞，具有较强的亲核性。②通过抑制P-gp过表达而起到克服肿瘤耐药性的作用。下一步研究中，我们将考察A-PL体内药动学特征及在组织中的分布特点，为进一步研究丙二醇脂质体作为药物载体体内给药奠定研究基础。