突破耐药基因组测序缺陷靶向测序对抗耐药菌新契机

　　自以抗生素为代表的抗菌剂问世以来，细菌对人类健康的危害得到了极大的控制。然而进入21世纪后，情况好似走入了另一个极端——由于抗生素滥用所致的耐药菌的出现以及广泛传播。这是由于在药物的选择压力下，敏感菌株被抑制或杀灭，天然耐药或获得性耐药菌株则继续生存、繁殖和克隆传播，导致细菌的耐药性增高。

　　细菌的多种耐药机制由大量耐药基因所编码。耐药菌在基因水平上的改变主要包括固有耐药性、获得耐药性以及多重耐药性。固有耐药性来源于细菌本身染色体上的耐药基因。获得耐药性则是由于敏感的细菌发生基因突变或获得外源性耐药基因所产生的。多重耐药性则是指细菌同时对多种不同作用机制，或结构完全各异的抗菌药物具有耐药性。当前在全世界范围内，多种病原菌甚至出现了多重耐药株，甚至泛耐药株。

　　但在细菌耐药形势愈发严峻的今天，培养法仍是病原菌药敏试验的主流通用标准，对于临床常见致病菌，培养法耗时长达24~48小时，对于难培养或生长缓慢的细菌则无能为力。临床实践上为了指导“精准用药”，急需针对细菌耐药性及其耐药机制的直接、快速测量技术。

　　近年来，携带NDM-1、MCR-1等耐药基因的“超级细菌”被不断发现。随着分子诊断技术的不断成熟、应用以及微生物基因检测产业的快速发展，大量的基因组分析方法被应用于测定微生物基因组序列。例如，“鸟枪法”（Metagenomics Shotgun Sequencing (MSS)），该方法通过将整个基因组打乱，切成随机碎片，然后测定每个小片段序列，再利用计算机对这些碎片进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。MSS方法检测速度快，简单易行，成本较低，但在检测低频率耐药基因时，MSS缺乏敏感性和特异性。

　　许多研究表明，全基因组测序对于识别基因突变非常重要,但如何保证有效的全基因组覆盖获得突变信息，当前除了不断加深测序深度，靶向捕获相关基因，后续再测序正在成为新时代的“宠儿”，解决全基因组覆盖不均一，漏检等实际问题。当需要测序的基因范围相对有限时，与全基因组测序相比，有针对性的基因组测序筛选是一种性价比更高的选择。遗传病诊断（WES/Panel）、肿瘤伴随诊断(肿瘤多基因Panel)、免疫治疗疗效预测（WES/Panel），这些NGS应用热点都是靶向测序打下的“江山”。2015年，有研究利用基于杂交捕获的靶向测序技术富集蜱虫体内的伯氏疏螺旋体基因组，数据有效率在70%以上（Roche SeqCap EZ Choice），揭示了靶向测序在传染病的病原体鉴定、细菌耐药谱分析中的巨大潜力。

　　对于有靶向基因测序技术，更加完整的覆盖相关基因是提高敏感性及特异性的核心。对于病原体鉴定而言，要求所靶向的基因不但要与固有耐药性相关（包括对抗生素、重金属、农药的耐药基因），还要包括获得性耐药相关基因。自2005年起，多种Antibiotic Resistance(AR)基因库相继出现，包括Antibiotic Resistance Genes Online (ARGO), Antibiotic Resistance Genes Database (ARDB), Resfinder, Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD)等等。其中，除了ResFinder 和 CARD以外，其他几种数据库并未进行全面而规律的更新。CARD数据库于2013年发布，以Antibiotic Resistance Ontology（ARO）为分类单位的形式所构建，其中ARO用于关联抗生素模块及其目标、抗性机制、基因变异等信息。ResFinder数据库的构建则是基于对whole genome studies (WGS) data的利用。但这些数据库并不支持检测基因点突变。ARG-ANNOT 是第一个可以检测与耐药性相关的基因点突变的数据库。

　　2016年11月29日，国内首款病原微生物基因检测软件获得药监局批文，进入临床应用。此后，国内数家企业开始布局NGS微生物基因检测。但这些用于病原体检测的靶向测序技术，仅包含以上AR数据库中的小部分数据，未能完整覆盖相关基因。SeqCap EZ ResCap Design突破了耐药传统基因组测序的缺陷，其靶向的基因包括来源于Arg-ANNOT, CARD, ResFinder, Bacmet, RED-DB等基因库的7,963 个耐抗菌素的相关基因片段，以及704个耐重金属及农药的相关基因片段。此外，SeqCap EZ ResCap Design同样包括了2517个来源于ConjDB数据库的释放酶基因（释放酶是一种遗传元件介导的获得性耐药的预测因子），这使得该产品在保证检测速度的同时，更加完整地覆盖了病原体检测相关的基因。罗氏素以其在探针设计上的精湛算法著称，独有的算法使得目标区域中的更多碱基序列可以直接设计探针，从而保证了目标区域的更高覆盖。

　　自上世纪90年代初，学界开始涉足“人类基因组计划”。近年来，基因测序从实验室走入临床，甚至逐渐成为全球医学界热门的话题。随着DNA测序技术的迅速发展, 其已经在流行病学诊断和药物敏感性预测等方面得到广泛应用, 研究对象也由简单的单个或几个基因及其作用转为全基因组的结构和功能。有数据显示，临床微生物检测的市场空间将达到400亿元。2015年，全球范围内微生物检测占IVD行业份额为18%，仅次于POCT。全基因组测序技术能够分析得到耐药基因及其突变情况, 除了已知的耐药机制, 还可用于预测未知的潜在耐药机制,。但是由于高成本的不足，使得全基因组测序在临床上的应用极为受限，因此，有针对性的基因组测序筛选是一种性价比更高的选择。基因组测序技术未来或将超越常规方法，成为耐药性研究的首选工具之一, 更加广泛地应用到疾病的诊断及治疗中。