师兄攻略：流式细胞术第一期

流式细胞仪和流式细胞术指南篇

历史

从 1968 年最早的商品化流式细胞术 (FC) 和荧光激活细胞分类术 (FACS) 诞生以来, 它们已得到大大改进。但要成为实验室广泛接受的技术，除成本因素外，还存在不少障碍。技术上的问题主要是细胞内低丰度分子的检测，缺少「通用」细胞通透物质，细胞自发荧光的干扰效应，荧光分子间发射光谱的重叠，以及缺少可识别目标分子的试剂。

特别是对于细胞分拣来说，由于液滴的形成收集、分拣细胞重分析或 培养前的稀释，以及为获得足够数量的可用细胞需要的时间延误的原因，还存在细胞存活问题。最后，特别是在处理低丰度对象时，数据分析也是很棘手的。

有一篇关于流式细胞仪理论的不错的综述，介绍了流式细胞仪的操作语言。此外，还有另一篇文章涵盖了提供流式细胞仪所用特定试剂的 主要抗体供应商。本文将聚焦于以下几点：

（1） 硬件的选择和注意事项

（2） 流式细胞仪和细胞分选的实际问题

（3）数据分析和软件。这几个话题包含的内容不展开论述

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流式细胞术的常用样品制备方法篇

流式细胞术的实验检测对象是单细胞悬液，因此，在组织化学和免疫组织化学实验中欲对待测样品细胞进行分类计数，也需把样品制备成细胞悬液，并要求被检细胞大小为 0.2～80 pm，每个样品中至少有 20 000 个细胞，细胞浓度为 10⁵ ～10⁷ 个／ml。制备成的单细胞悬液经荧光或免疫荧光标记即可上机检测。

1. 单层培养细胞单细胞悬液的制备

（1）弃去培养细胞(对数生长期)中的旧培养液，加入 1～2ml 0.25％ 胰蛋白酶，倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，停止胰蛋白酶作用。也可直接观察培养 瓶，静置消化 2～3 分钟，待细胞逐渐变白，有脱落趋势时，立即竖立培养瓶，停止胰蛋白酶作用，弃去胰蛋白酶；

（2）加入 3～4 ml 无钙离子和镁离子的 PBS 液，用吸管反复吹打，使其分散为单个细胞悬液，移入离心管中；

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2. 流式细胞术数据处理与分析

数据的显示，通常可分为一维单参数直方图（histogramplot）、二维点图（dotplot）、二维等高图（contour）和假三维图（pseudo3D）等。下面简述最常用的单参数直方图和二维点图。

单参数直方图单参数直方图是一维数据用得最多的图形，可用来进行定性分析和定量分析。横坐标表示荧光信号或散射光信号强度的相对值，其单位用「道数」（channel）表示，横坐标可以是线性的，也可以是对数的。纵坐标通常代表细胞出现的频率或相对细胞数。下面以研究细胞周期为例说明如何分析单参数直方图所表达的信息。

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3. 如何看流式细胞术结果中的图

流式细胞结果图

FCM 数据的存贮的方式是 FCS 2.0（flow cytometry standard），采用列表排队 (List Mode) 方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。

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流式细胞术常见问题篇

1. 流式细胞仪上的 FL2-W、 FL2-A、 FL2-H 分别是做什么的？

FL2-W 是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H 是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。

2. 流式同型对照怎样选择？

同型对照（IsotypeControl）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用 annormal serum（与一抗相同的正常血清）