高通量新方法鉴定二甲双胍作用的关键细菌效应因子

　　微生物在宿主健康的调控过程中起着关键作用，诸如药物和饮食等环境因素可以改变微生物的生态和功能，进而对宿主健康产生重要影响【1】。二甲双胍（metformin）是治疗2型糖尿病最常用的药物，另外二甲双胍还可以增加2型糖尿病患者的生存。它以一种进化上保守的方式与微生物互作，进而调控宿主生理【2】。另一方面，营养在调控宿主和微生物生理以及药物疗效方面也发挥着关键作用【3】。然而，对于宿主-细菌-药物-营养四者之间相互作用的因果动态关系仍知之甚少，微生物通过营养依赖性方式发挥调控作用的具体机制也不甚清楚。由于微生物代谢复杂，以及原核生物调控宿主相关通路的代谢产物数量庞大，解析这一过程是一个巨大的挑战。

　　2019年8月29日，来自MRC伦敦医学科学研究所的Filipe Cabreiro教授与德国基尔大学的Christoph Kaleta教授团队，在Cell联合发表题为Host-Microbe-Drug-Nutrient Screen Identifies Bacterial Effectors of Metformin Therapy的论文，该工作首先开发了一种研究宿主-微生物-药物-营养物质相互作用的高通量筛选平台，以便在宿主和微生物相互作用的背景下，对药物的营养调节进行评价；并最终发现微生物可以通过磷酸转移酶通路整合二甲双胍和饮食信号，从而影响宿主的脂类代谢和寿命。

　　已有研究表明，二甲双胍能够通过诱导线虫饮食限制的方式调节机体寿命【4】。Acs-2是酰基辅酶A (CoA) 合酶的同源基因，调节脂肪酸在饮食限制条件下的β-氧化激活，作者利用转基因线虫株系Pacs-2：：GFP，作为饮食限制条件下转录反应的指示物，发现二甲双胍能够抑制细菌的生长，延长宿主寿命，并促进Pacs-2：：GFP的表达。

　　为探究影响二甲双胍通过细菌依赖性方式影响宿主寿命的营养因素，作者开发了一种高通量四向宿主-微生物-药物-营养相互作用的筛选方法（图1），并绘制了四者之间相互作用的图谱。其中，37种营养因素能够补救二甲双胍介导的细菌生长抑制作用，并抑制二甲双胍在线虫体内激活Pacs-2：：GFP，表明特定的营养条件能够调控二甲双胍经由细菌影响宿主的代谢过程。为进一步确定这种营养因素，研究者对细菌生长和宿主线虫Pacs-2：：GFP数据进行EcoCyc代谢物富集分析，发现碳水化合物、醛或羧化物（如D-葡萄糖、D-核糖和丙三醇）等糖代谢相关营养因子能够补救二甲双胍对细菌生长的影响，同时以细菌依赖性的方式影响二甲双胍对宿主代谢和寿命的调节，表明细菌中存在特定的通路，能够整合营养因素和二甲双胍的影响，从而调控宿主的生理状态。为揭示这一过程，作者对线虫和E. coli进行KEGG通路分析，发现半乳糖代谢和磷酸转移酶系统（phosphotransferase system，PTS）分别是关键的宿主代谢和细菌信号通路，介导了二甲双胍对宿主生理的影响。

图1 宿主-微生物-药物-营养相互作用的四向筛选图

　　结合E. coli在二甲双胍处理与未处理条件下的蛋白质组分析，以及RegulonDB数据库，作者发现11个细菌转录因子（TFs）能调控二甲双胍对细菌生长、宿主代谢和寿命的影响。细菌的基因敲除实验表明转录调控因子Crp和ArgR，分别调节碳代谢和氮代谢，这两种细菌信号传导机制介导了二甲双胍对宿主代谢和寿命的影响。

　　PTS是细菌中重要的主动运输系统，协调碳水化合物分子的摄取，并通过一系列的磷酸化反应下游调控Crp（图2），Crp与其结合伴侣cyclic AMP（cAMP）能够对营养环境做出反应，直接控制上百个基因的转录，并相应地调整代谢过程【5】。作者对这一信号通路的不同步骤进行干预，均降低了二甲双胍对宿主生理的影响，表明PTS是通过二甲双胍对下游代谢产生影响从而调节宿主的寿命。进一步研究发现二甲双胍可以促进Crp的表达，且PTS功能的激活需要TF及其辅因子共同作用，从而影响宿主健康。随后，作者发现这种现象也存在于果蝇中，当肠道内定植有OP50 E. coli时，二甲双胍能够延长果蝇的寿命，而不影响无菌或定植△crp突变菌的果蝇寿命，表明这一细菌通路在调控宿主寿命方面存在进化上的保守性。

图2 大肠杆菌中PTS-Crp信号通路示意图

　　Crp参与调控细菌中多种代谢过程，为探究与宿主寿命相关的细菌Crp-依赖性代谢途径，作者通过代谢组学分析以及构建细菌敲除突变体的方法，发现与胍丁胺（agmatine）分解代谢相关的speB突变株能够显著促进宿主Pacs-2：：GFP表达，表明宿主代谢和寿命与细菌胍丁胺的产生直接相关，而与大分子营养环境变化无关。随后，作者利用E. coli OP50作为代谢模型，探究营养条件对胍丁胺产生的影响，发现糖类不能增加细菌胍丁胺的产生，与四向筛选结果一致。In silico模型预测四向筛选结果显示多种代谢产物，以二甲双胍依赖性的方式，促进细菌胍丁胺的产生，进而发挥其功能。

　　为确定细菌胍丁胺的产生与人类二甲双胍治疗之间的联系，研究者通过16S rRNA测序，发现二甲双胍治疗的2型糖尿病患者，其胍丁胺产生显著高于未治疗的患者以及健康肥胖或瘦人对照。由四向筛选得到的模型数据，表明二甲双胍与微生物群的相互作用，以一种营养依赖性的方式促进了胍丁胺的产生，作为结果，细菌其它代谢产物（如短链脂肪酸）也有助于二甲双胍有益功能的发挥。

　　为进一步探究二甲双胍介导的Crp和胍丁胺依赖性方式影响宿主寿命的分子机制，作者对宿主线虫进行了多组学分析，其中KEGG分析表明二甲双胍介导的寿命表型与过氧化物酶体和脂肪酸代谢通路显著相关。在添食OP50的线虫中，二甲双胍处理能够上调肠内与脂肪代谢相关基因表达，减小脂滴的尺寸，并增加过氧化物酶体的丰度。干扰线粒体和过氧化物酶体等相关脂肪酸氧化（Fatty acid oxidation, FAO）代谢过程的基因表达，可以抑制二甲双胍处理、胍丁胺补充和细菌CRP过表达介导的寿命延长，表明二甲双胍所介导得寿命延长，是通过宿主内细菌依赖性的FAO进行的。

　　综上，该研究通过高通量四向宿主-细菌-药物-营养之间互作筛选以及in silico人类微生物代谢建模的方法，发现细菌能够通过PTS、糖摄取以及下游转录因子Crp这一代谢信号轴，整合营养和药物信号。随后进一步揭示了细菌代谢物胍丁胺，是二甲双胍影响线虫和果蝇脂肪代谢和寿命过程的关键（图3）。该项研究深入剖析了微生物代谢物与宿主之间进化上的保守联系，并明确了药物和营养等环境因素所发挥的调节作用。

图3 调控二甲双胍对宿主代谢和寿命影响的宿主-微生物-药物-营养相互作用模型

　　原文链接：

　　https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.08.003

　　制版人：珂

　　参考文献

　　1. Maier, L., Pruteanu, M., Kuhn, M., Zeller, G., Telzerow, A., Anderson, E.E., Brochado, A.R., Fernandez, K.C., Dose, H., Mori, H., et al. (2018). Extensive impact of non-antibiotic drugs on human gut bacteria. Nature 555, 623–628.

　　2. Bauer, P.V., Duca, F.A., Waise, T.M.Z., Rasmussen, B.A., Abraham, M.A., Dranse, H.J., Puri, A., O’Brien, C.A., and Lam, T.K.T. (2018). Metformin Alters Upper Small Intestinal Microbiota that Impact a Glucose-SGLT1-Sensing Glucoregulatory Pathway. Cell Metab. 27, 101–117.e5.

　　3. David, L.A., Maurice, C.F., Carmody, R.N., Gootenberg, D.B., Button, J.E., Wolfe, B.E., Ling, A.V., Devlin, A.S., Varma, Y., Fischbach, M.A., et al. (2014). Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature 505, 559–563.

　　4. Onken, B., and Driscoll, M. (2010). Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PLoS ONE 5, e8758.

　　5. Chubukov, V., Gerosa, L., Kochanowski, K., and Sauer, U. (2014). Coordination of microbial metabolism. Nat. Rev. Microbiol. 12, 327–340.