QuEChERS法色质联用技术检测加工番茄中99种农药残留

QuEChERS法-色质联用技术检测加工番茄及制品中99种农药残留

　　目前，我国番茄制品产量仅次于美国，是世界第二大加工番茄生产国，年出口量100×104 t，成为我国五大出口蔬菜制品之一，占全球番茄酱的贸易总量已从1999年的7.7%上升到2016年的40%，是世界第一大番茄制品出口贸易国。 
　　随着加工番茄种植、采收模式的调整，各类杀虫剂、杀菌剂在番茄种植过程中普遍使用，欧盟、日本等番茄制品主要进口国对番茄酱农药残留限量制定了严苛的限量标准[1-4]。试验采用QuEChERS前处理方法，充分利用分散固相萃取的技术原理，建立了适合番茄及番茄制品基质99种农药的检测方法，有效提高了工作效率，显著降低了成本。该方法的精密度、灵敏度及方法检出限能同时满足欧盟、日本肯定列表和国标的要求。 
　　1   试验部分 
　　1.1   仪器 
　　AL01型分析天平（0.1 mg），METTLER TOLEDO公司产品;超高效液相色谱串联质谱仪;UPLC-MSMS（WATERS）;气相色谱串联质谱（AGILENT 5973N，6890）;色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm（2.1 mm×50 mm）。 
　　1.2   试剂 
　　乙腈（HPLC级）、乙酸铵（HPLC级）、乙酸（HPLC级）、甲酸（HPLC级）、氯化钠（AR级）、乙酸钠（AR级）、无水硫酸镁（AR级）、乙二胺- N -丙基硅烷（PSA）、实验室用水均为一级水。 
　　农药标准品包括甲基硫环灵、氧乐果、甲胺磷、敌敌畏等99项农药标准品，质量浓度均为100 μg/mL。 
　　1.3   标准溶液的配制 
　　混合标准溶液：分别吸取99种农药标准品200 μL～ 10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配置成2 μg/mL 混合标准溶液。 
　　基质匹配混合标准工作溶液：用空白样品提取液配成不同质量浓度的基质匹配混合标准工作溶液，用于建立标准曲线。基质匹配混合标准工作溶液应现用现配。 
　　1.4   样品前处理 
　　（1）样品制备。取代表性样品约500 g，匀浆搅拌后备用。 
　　（2）样品提取。称取5 g（准确至0.01 g）样品于50 mL塑料离心管中（若样品为番茄酱，则需要加入5 mL水），涡旋混匀，准确加入 质量分数为1%的乙酸-乙腈20 mL、4 g氯化钠和1 g 乙酸钠;使用恒温振荡器振荡15 min，随后放入超声波发生器中超声提取20 min，超声过程中需控制水温上升;超声结束后以转速8 000 r/min离心5 min。 
　　（3）样品除水。吸取全部离心后上清液于50 mL 塑料离心管中，加入6.00 g无水硫酸镁，放入恒温振荡器中振荡15 min，以转速8 000 r/min离心5 min。 　　（4）样品净化。取12 mL上清液于50 mL塑料离心管中，准确加入1.00 g 无水硫酸镁和0.250 g PSA（样品若为番茄酱，则称取0.400 g PSA），放入恒温振荡器中振荡15 min，以转速8 000 r/min离心5 min。 
　　（5）样品浓缩及上机。取上清液8 mL 于玻璃氮吹管中，于35 ℃水浴中氮吹浓缩至1 mL以下，再用乙腈复溶至1 mL;涡旋混匀后过膜上机。 
　　1.5   色谱及质谱条件 
　　（1）液相色谱条件。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm（2.1 mm×50 mm Column），柱温35 ℃，样品温度4 ℃，进样体积3 μL。流动相为乙腈和含0.1%甲酸的乙酸铵水溶液，流速为0.2 mL/min。 
　　流动相梯度条件见表1。 
　　（2）LCMMS条件。正离子模式（EI+），选择离子扫描（MRM），毛细管电压3.5 kV，锥孔电压28 V，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度450 ℃，碰撞气流量700 L/hr，锥孔气流量50.0 L/hr。 
　　（3）气相色谱条件。进样口温度250 ℃，程序初始温度80 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升温至280 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min 升温至300 ℃，保持3 min。载气为高纯氮，流速为1.0 mL/min，不分流进样，进样量1 μL。 
　　（4）质谱条件（GCMS）。电子轰击电离源（EI），电离能量70 eV，四级杆温度150 ℃，传输线温度300 ℃，离子源温度230 ℃，选择离子扫描，溶剂延迟3 min。 
　　2   结果与讨论 
　　2.1   基质匹配曲线的配制 
　　不同农药在pH值稳定性的不同，配制含有多个农药标准工作液都是由一定体积的储备液经适量的乙腈稀释混合而成。混合标准工作液的浓度应足够用于配制所需的基质匹配标准溶液。基质匹配标准溶液须用空白样品的提取液经适当稀释配制，空白样品基质的用量不超过定容体积的20%，以避免样品提取液与基质匹配之间因基质增强效应引起的误差。 
　　2.2   提取溶剂的选择 
　　采用0.1%甲酸乙腈提取，是由于所检测的农药大多为极性较大的农药。 
　　2.3   净化条件 
　　制备均匀的样品用乙腈提取。低水分含量的样品（水分含量<80%）在提取前需要加入5 g水。 
　　在提取液中加入氯化钠剧烈振摇后离心，使固相和液相分离。有机相用分散固相萃取法净化，净化过程中加入一定量的硫酸镁去除有机相中残留水分。浸提液中加入少量甲酸进行酸化后接着加入吸附剂（如PSA），酸化有助于保持农药的稳定性，提高分析的灵敏度。 
　　2.4   仪器条件的优化 
　　LC-MS/MS所有农药质谱参数均采用流动注射的方式，通过调试寻找毛细管电压、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能等参数。GC-MS所有农药均直接采用Agilent 数据库中农药质谱参数。 
　　2.5   方法学考查 
　　2.5.1   定性与定量 
　　（1）定性方法。在相同试验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致（相对丰度>50%，允许±20%偏差;相对丰度>20%～50%，允许±25%偏差;相对丰度>10%～20%，允许±30%偏差;相对丰度≤10%，允许±50%偏差），则可判断样品中存在该种农药或相关化学品。 
　　（2）定量方法。使用响应值较高的离子对为定量离子对，通过基质匹配混合标准工作溶液用外标法定量。 
　　2.5.2   方法的线性范围与检出限 
　　使用空白番茄酱样品的最终净化液作为基质匹配标准溶液的稀释液，分别以99种农药的质量浓度对应的定量离子色谱峰的峰面积绘制基质匹配标准溶液工作曲线，获得相应的线性方程及相关系数。99种农药化合物的线性关系良好，相关系数R2>0.98。 
　　99种农药化合物的基质匹配标准溶液工作曲线和相关系数见表2。 
　　2.5.3   回收率和精密度试验 
　　为验证方法的可靠性和重复性，分别进行4个水平的添加回收率试验，每个水平做6个平行样品测定，该方法测定番茄酱中99种农药的平均回收率均在73.6%～118.4%，相对标准偏差（RSD）小于16%。 
　　34种农药（LC/MSMS）的平均加标回收率和相对标准偏差见表3，65种农药（GC/MS）的平均加标回收率和相对标准偏差见表4。 
　　3   结语 
　　采用了QuEChERS前处理方法，LC-MS/MS和GC-MS 2台仪器测定了番茄及番茄酱中99项常见农药残留。99种农药在0.01～0.50 mg/kg含量范围内线性良好，R2≥0.980，且平均回收率为73.6%～ 118.4%，相对标准偏差≤16%。该方法操作简单、快速、高效、成本较低，具有较好的灵敏度和精密度，适合在番茄及番茄制品相关生产加工企业中推广。