固相微萃取高效液相色谱法分析爽肤水中痕量雌激素

发布时间：2019-10-24 18:41 原文链接：固相微萃取高效液相色谱法分析爽肤水中痕量雌激素

整体柱在线固相微萃取-高效液相色谱法分析爽肤水中痕量雌激素

近年来, 化妆品的安全问题引起了人们的广泛关注^[1, 2]。我国化妆品卫生规范(2007版)^[3]列出了1 208种禁用物质，其中明确指出了性激素。雌激素是性激素的一种, 是一类生物活性广泛的类固醇化合物^[4], 具有促进、维持女性生殖器官和第二性征的生理作用, 同时对内分泌系统、肌体代谢、骨骼生长等有显著影响^[5]。长期服用添加雌激素的食品或使用含雌激素的化妆品会引起体内雌激素水平的增高^[6], 从而引发人体新陈代谢紊乱甚至癌症^[7, 8]。因此, 对化妆品中雌激素的分析、检测具有重要意义。

目前, 常用的分离介质有填充柱^[9]、开管柱^[10]和整体柱^[11]等。填充柱的填充步骤相对复杂, 制备过程中固定相易受外界条件的影响(如高温烧结可能会破坏键合固定相)^[12]; 开管柱的制备过程简单、柱效高^[13], 但其柱容量低、相比小^[14]。整体柱材料作为萃取介质在复杂样品的前处理, 尤其是小分子的分离分析方面具有广泛的应用^[15]。通过原位聚合反应的整体柱具有制备方法简单、重复性好、柱压低等优点。聚甲基丙烯酸酯类整体柱稳定性高、适用范围宽且材料表面易改性, 故本实验以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂, 偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂, 在毛细管中通过原位反应制备了整体柱。

雌激素样品的前处理方法主要包括传统的液液萃取法^[16]、固相萃取法^[17]和液相微萃取法^[18]等。李晶瑞等^[16]采用甲醇提取、超高效液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中的15种雌激素, 方法准确、灵敏, 但溶剂消耗量大; Wang等^[18]采用中空纤维液相微萃取法萃取了牛奶中的雌激素, 方法操作简单、成本低且环境友好, 但耗时长。采用整体柱在线微萃取法与HPLC联用可以有效避免复杂基质的干扰、富集倍数高、重现性好, 分析效率高^[19], 且溶剂消耗量小, 是一种高效、环境友好的萃取方法^[20]。

本文采用在毛细管内引发原位聚合反应的方式制备了聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(Poly (GMA-co-EDMA))整体柱, 并将其与HPLC联用, 搭建了在线固相微萃取-HPLC联用装置, 实现了爽肤水中痕量17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)、炔雌醇(ethynyl estradiol, EE)、雌酮(estrone, E1)和己烯雌酚(diethylstilbestrol, DES)的在线分析。该方法简单、快速、灵敏、准确且环境友好。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-10AVP高效液相色谱仪(包括CLASS-VP工作站、SPD-10AVP紫外检测器)、AVATAR-330傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪(日本岛津公司); Quanta 400F热场发射环境扫描电镜-能谱-电子背散射衍射系统(荷兰FEI/OXFORD/HKL公司); 石英毛细管(内径0.53 mm)(河北省永年县锐沣色谱器件有限公司)。

EDMA购自广州市千湖贸易有限公司; 正己烷、聚乙二醇-400(PEG-400)、1, 4-丁二醇、正丙醇均购自广州化学试剂厂; AIBN购自天津市福晨化学试剂厂; GMA (纯度97%)购自上海麦克林试剂公司; E2(纯度＞99%)、EE (纯度≥98%)、E1(纯度＞98%)标准品购自阿拉丁试剂(上海)有限公司; DES (纯度＞98%)标准品购自中国药品生物制品检定所; γ-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(KH-570)购自北京市申达精细化工有限公司; 乙腈、甲醇(色谱纯)购自美国Dikma公司。所有实验用水均为超纯水(美国Millipore公司), 其余试剂均为分析纯。

标准溶液的配制:称取适量雌激素标准品, 用甲醇配制成合适质量浓度的标准溶液; 用超纯水稀释成所需质量浓度的标准工作液。

1.2 整体柱的制备

将石英毛细管用甲醇洗净, 烘干, 注入1 mol/L氢氧化钠溶液, 浸泡2 h后, 用清水洗净, 再注入1 mol/L盐酸溶液, 浸泡2 h后, 用甲醇以0.1 mL/min的流速清洗, 于150 ℃烘箱烘2 h, 然后将KH570-甲醇混合物(1:1, v/v)注入毛细管柱中, 于室温下反应4 h, 然后用甲醇清洗, 氮气吹干后, 硅胶封口, 保存备用。

准确称取4.0 mg AIBN、168 μL GMA、200 μL EDMA、700 μL甲醇和250 μL正己烷于色谱样品瓶中, 超声20 min, 混匀, 制成聚合反应液, 将其注入预处理过的石英毛细管中, 用硅胶密封, 于65 ℃反应10 h。待反应完成后, 将聚合好的整体柱用甲醇以0.1 mL/min的流速冲洗, 除去残余的单体和致孔剂。制备反应的方程式见图 1。

图 1 Poly (GMA-co-EDMA)整体柱的制备过程Fig. 1 Preparation process of the Poly (GMA-co-EDMA) monolithic column

1.3 在线固相微萃取

将长为12.7 cm的Poly (GMA-co-EDMA)整体柱作为萃取单元, 通过聚醚醚酮(PEEK)连接头、PEEK管、不锈钢双通阀、六通阀与高效液相色谱系统构成整体柱在线微萃取分析流路(见图 2)。在实验过程中通过2个六通阀的切换来完成平衡、萃取、解吸和进样(见表 1)。在线萃取装置中, 所接进样环的体积为4 mL, 用于载入样品溶液。萃取时携带液经过定量环, 推动样品溶液经过萃取单元, 完成萃取。萃取条件：萃取溶剂为5%(v/v)乙腈水溶液; 萃取流速为0.3 mL/min；萃取体积为3 mL；解吸溶剂为乙腈-水(45:55, v/v); 解吸流速为100 μL/min。

图 2 Poly (GMA-co-EDMA)整体柱在线固相微萃取装置图Fig. 2 Schematic diagram of the Poly (GMA-co-EDMA) monolithic column online solid phase microextraction system

表 1 在线固相微萃取系统的操作流程Table 1 Operation procedures of online solid phase microextraction system

1.4 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(250 mm×4.60 mm, 5 μm, 北京迪马公司); 柱温:30 ℃; 流动相:(A)乙腈, (B)水; 流速:1.0 mL/min; 梯度洗脱程序:0~16 min, 45%A~73%A; 紫外检测波长:230 nm。

2 结果与讨论

2.1 致孔剂的选择

本实验控制引发剂用量为单体用量的1%(质量分数), 以柱压来表征整体柱的通透性, 考察了不同的致孔剂组合(正丙醇和1, 4-丁二醇^[21]、甲醇和正己烷、正丙醇和PEG-400^[22])及其配比对整体柱通透性的影响。研究结果表明, 当正丙醇与1, 4-丁二醇的质量比为45:55时, 制备的整体柱在甲醇冲洗流速为0.1 mL/min的条件下，柱压为1.5×10⁶ Pa; 当正丙醇与PEG-400的质量比为47:53时, 整体柱的柱压超过3.0×10⁶ Pa (冲洗流速0.1 mL/min), 且整体柱中的内容物流出; 而当选择甲醇-正己烷(14:5, v/v)作为致孔剂时, 制备的整体柱在较大冲洗流速(0.5 mL/min)下, 柱压仅为1.5×10⁶ Pa。可能的原因为1, 4-丁二醇熔点较高(20.2 ℃), 在实验温度(约20 ℃)下仍有部分1, 4-丁二醇处于凝固状态, 未反应的单体和致孔剂难以被冲出, 导致柱压增大; 而PEG-400溶液的黏度过高, 从而导致柱压过高。故最终选择甲醇和正己烷(14:5, v/v)作为二元致孔剂, 制备Poly (GMA-co-EDMA)整体柱。通常整体柱的柱压会随着流速的增加而增大, 选用甲醇和正己烷作致孔剂时, 可以有效降低柱压, 使整体柱在较高冲洗流速下也可保持良好的通透性。同时将后续优化实验中的萃取流速初步设为0.5 mL/min。

2.2 Poly (GMA-co-EDMA)整体柱的表征