QuEChERS测定水果中21种植物生长调节剂的残留量

植物生长调节剂是一类具有植物激素活性,可影响植物生长发育的小分子化合物^[1]。根据来源的不同,植物生长调节剂可分为天然植物激素和人工合成两种。按作用方式可分为生长促进剂、生长延缓剂和生长抑制剂。这类化合物在增强植物抗逆性、促进植物细胞分裂与生长、提高产量以及改善品质等方面发挥着重要的作用,为农业生产和发展做出了巨大的贡献。然而,随着科技与农业的发展,植物生长调节剂的种类越来越多,应用也日益广泛,盲目或过量使用的现象时有发生,影响到农产品的品质安全,对公众的健康造成了潜在的威胁。因此,针对植物生长调节剂各国制定了相应的最大残留限量(MRL)标准,如日本规定抗倒酯在苹果、西瓜中MRL为0.02 mg/kg,欧盟规定丁酰肼在苹果、西瓜中的MRL为0.02 mg/kg,中国规定氯吡脲在葡萄中的MRL为0.05 mg/kg,英国规定矮壮素在西瓜和葡萄中MRL为0.05 mg/kg 等。

目前,国内外有关植物生长调节剂残留的检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)^[2,3]、气相色谱法(GC)^[4,5,6]、气相色谱-质谱法(GC-MS)^{[7,8,9,10,11]}、高效液相色谱法(HPLC)^[12,13,14]、液相色谱-质谱法(LC-MS)^{[15,16,17,18,19,20,21,22]}和离子色谱法(IC)^[23]。采用ELISA易产生假阳性,运用GC和GC-MS时通常要进行衍生化的复杂操作,HPLC的灵敏度较低且难以实现确证分析。液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)具有高特异性和高灵敏度,是目前广泛应用的检测方法。国内外已有采用LC-MS/MS测定植物生长调节剂残留的报道,但这些报道所涉及的种类较少,不能满足国内外快速检测样品的要求。本文通过优化质谱参数和色谱条件,考察流动相、提取方法和基质效应等因素,建立了HPLC-MS/MS同时测定水果中21种植物生长调节剂残留的分析方法。

1 实验部分跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献

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Agilent 6460三重四极杆质谱,配Agilent 1290高效液相色谱仪(美国Agilent),Agilent Jet Stream电喷雾离子源(AJS ESI); IKA T18 Basic均质器(德国IKA);离心机(上海安亭科学仪器厂); 固相萃取装置(美国Supelco)；氮吹仪(美国Caliper)；涡旋混匀器(IKA 3 Basic，德国IKA)；Milli Q超纯水系统(美国Millipore)。

乙腈和甲醇(色谱纯,德国Merck);甲酸(色谱纯,美国Fluka),乙酸铵(色谱纯,美国TEDIA),乙酸和氢氧化钠为分析纯;实验用水符合GB/T 6682规定要求。21种植物生长调节剂标准品:氯化胆碱(choline chloride)、矮壮素(chlormequat chloride)、助壮素(mepiquat chloride)、丁酰肼(daminozide)、赤霉素(gibberellic acid,GA3)、6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)、吲哚-3-乙酸(indol-3-ylacetic acid,IAA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、1-萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid,NAA)、噻苯隆(thidiazuron)、2,4-D、调果酸(cloprop)、2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-triiodobenzoic acid,TIBA)、对氯苯氧乙酸(4-chlorophenoxyacetic acid,4-CPA)、氯吡脲(forchlorfenuron)、环丙酸酰胺(cyclanilide)、抗倒胺(inabenfide)、抗倒酯(trinexapac-ethyl)、多效唑(paclobutrazol)、烯效唑(uniconazole)和抑芽唑(triapenthenol)(纯度均大于96% ,德国Dr. Ehrenstorfer)。

称取适量标准品,分别用甲醇配制成100 mg/L 的储备液并储存在-4 ℃冰箱中。根据实验需要用乙腈稀释标准储备液,配成适当浓度的标准工作溶液。

1.2 样品前处理跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献

称取10.00 g(精确至0.01 g)样品于50 mL离心管中,加入10 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液,匀浆2 min后,加入脱水试剂(4 g无水硫酸镁和1.5 g醋酸钠),涡旋振荡1 min,以 4 000 r/min 离心3 min,取2.0 mL上清液于分散固相萃取管(25 mg C18和150 mg无水硫酸镁)中,涡旋混匀1 min后于 16 000 r/min 速率下离心5 min,所得上清液经0.22 μ m有机滤膜过滤后,待测定。

表1 21种植物生长调节剂的质谱分析参数Table 1 MS/MS parameters of the 21 plant growth regulators

1.3 HPLC-MS/MS条件跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献

色谱柱:Agilent XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μ m)。流动相A: 5 mmol/L 乙酸铵-0.05%(v/v)甲酸水;流动相B:乙腈;梯度洗脱程序:0～2 min,5%B; 2～12 min,5%B～80%B; 12～18 min,80%B; 18.1 min,5%B; 18.1～24 min,5%B。流速:0.5 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:5 μ L。采用AJS ESI源,正离子、负离子分段多反应监测模式(MRM)检测(其中第1段:0～5 min,正离子扫描;第2段:5～13 min,负离子扫描;第3段,13～24 min,正离子扫描)。雾化气压力:310.3 kPa;喷嘴电压:500 V;干燥气温度与流速:300 ℃,10 L/min;鞘气温度与流速:375 ℃,11 L/min;毛细管电压:4 000 V。21种植物生长调节剂的定量和定性离子、碰撞能量和碎裂电压等参数见表1。

2 结果与讨论跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献

2.1 质谱条件优化跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献

使用单针自动进样分析目标化合物的标准溶液,优化21种植物生长调节 剂的质谱条件。化合物进入一级质谱后,可产生稳定的[M+H]⁺离子或[M-H]^-离子。其中6-苄氨基嘌呤、噻苯隆、氯吡脲和抗倒胺可产生[M+H]⁺离子,也可以形成稳定的[M-H]^-离子,在综合考虑灵敏度与分段扫描等因素后,最终选用6-苄氨基嘌呤、噻苯隆和氯吡脲的[M-H]^-离子为母离子,抗倒胺的[M+H]⁺离子为母离子;确定了化合物母离子后,在SIM模式下,对化合物的Fragmentor(碎裂电压)进行优化;母离子进入二级质谱,发生断裂或重排等反应产生不同的离子碎片。在Product Ion模式下,对化合物母离子施加一定量的碰撞能量(CE),得到其相应的离子碎片;最后在MRM模式下,优化目标物离子碎片的最佳碰撞能量。21种植物生长调节剂的二级离子质谱图见图1,MRM色谱图见图2。

2.2 色谱条件优化跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献跳转到：本文顶部　1 实验部分　    1.1 仪器与试剂　    1.2 样品前处理　    1.3 HPLC-MS/MS条件　2 结果与讨论　    2.1 质谱条件优化　    2.2 色谱条件优化　    2.3 提取溶剂的选择　    2.4 净化条件的优化　    2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限　    2.6 准确度和精密度　3 小结　参考文献

实验对比了Thermo Accucore-C18(100 mm×2.1 mm,2.6 μ m)、Phenomenex Kinetex-C18(100 mm×2.1 mm,2.6 μ m)和Agilent XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μ m)色谱柱对待测物分离的效果。 由于21种待测物的极性差异较大,极性较强的丁酰肼、矮壮素、助壮素和氯化胆碱在反相色谱柱上的保留较弱,且在Thermo Accucore-C18和Phenomenex Kinetex-C18的保留时间均小于2 min,而在Agilent XDB-C18柱上的保留大于2.5 min。因此,选取了Agilent XDB-C18色谱柱来分析待测物。

分析物的测定采用正离子和负离子模式,本研 究采用的质谱仪毛细管支持正负模式快速切换。试验比较了分段与不分段对待测分析物灵敏度的影响,如图3所示,采用分段的方法分析物的分离度与峰形较好,同时也提高了大部分待测分析物的灵敏度。因此,本研究通过对流动相与洗脱梯度的优化后,以不同的离子扫描模式将分析监测过程分为3段。

图1 21种植物生长调节剂的二级离子质谱图Fig. 1 MS/MS spectra of the 21 plant growth regulators1. choline chloride; 2. chlormequat chloride; 3. mepiquat chloride; 4. daminozide; 5. GA3; 6. 6-benzylaminopurine; 7. IAA; 8. ABA; 9. NAA; 10. thidiazuron; 11. 2,4-D; 12. cloprop; 13. trilodobenzoic acid; 14. 4-CPA; 15. forchlorfenruon; 16. cyclanilide; 17. inabenfide; 18. triexapac-ethyl; 19. paclobutrazol; 20. uniconacole; 21. triapenthenol.

图 2 21种植物生长调节剂的MRM色谱图Fig. 2 MRM chromatograms of the 21 plant growth regulators1. choline chloride; 2. chlormequat chloride; 3. mepiquat chloride; 4. daminozide; 5. GA3; 6. 6-benzylaminopurine; 7. IAA; 8. ABA; 9. NAA; 10. thidiazuron; 11. 2,4-D; 12. cloprop; 13. trilodobenzoic acid; 14. 4-CPA; 15. forchlorfenruon; 16. cyclanilide; 17. inabenfide; 18. triexapac-ethyl; 19. paclobutrazol; 20. uniconacole; 21. triapenthenol.s

图 3 分段采集模式和正负离子快速切换模式对化合物分离效果的影响Fig. 3 Effect of separation of compounds in segment mode and quick swiching modea. segment mode; b. quick swiching mode.

液相色谱-质谱分析中有机相通常使用乙腈,水相常使用甲酸水溶液、乙酸铵水溶液或甲酸-乙酸铵水溶液。通过试验对比,使用同时含5 mmol/L 乙酸铵和0.05%(v/v)甲酸时,待测物的分离度和峰形都比较好。因此,本文选择流动相水相为含5 mmol/L 乙酸铵和0.05%(v/v)甲酸的水溶液,有机相为乙腈。