实验方法原理 |
1. 从动物或人组织中提取的细胞,在体外培养中,细胞会有不同程度的分裂增殖,称为增殖性衰老 。但是有些细胞在自发或其他条件诱导下可突破增殖性衰老,拥有无限增殖的能力,成为永生化细胞,骨髓来源的间充质干细胞属于多能干细胞,可作为组织工程种子细胞的来源。 2. 端粒酶对染色体的稳定性及决定细胞生命周期起极其重要的作用。端粒酶或末端转移酶是由两个主要的亚单位构成:RNA成分(hTR)和蛋白质分解亚单位(hTERT),RNA(hTR)亚单位普遍表达于正常和肿瘤组织中,而蛋白质分解亚单位(hTERT)仅在肿瘤细胞、生殖谱系细胞及激活的淋巴细胞中表达。 3. 细胞衰老机制现在管遍接受的是细胞衰老两阶段模型-M1/M2模型,细胞在生长过程中,经过多次分裂后,在肿瘤抑制因于p53和pRb等作用下,细胞对生长因子的反应消失,出先有丝分裂反应的消失,DNA合成抑制蛋白的产生。DNA合成停止,细胞不可逆的停滞于G1期,发生衰老(sesence. M期),细胞发生凋亡或死亡,永生化指的是在体外培养的细胞自发的或受外界影响从增殖衰老中逃离,从而具有无限增殖能力的过程。 |
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实验材料 | 人间充质干细胞 |
试剂、试剂盒 | 葡萄糖 L-谷酰胺 胎牛血清 青霉素 链霉素 聚凝胺 |
仪器、耗材 | 培养瓶 多孔板 |
实验步骤 |
材料 生长培养基:含高浓度葡萄糖(4.5 g/L)的 Dulbecco's modifiled Eagle's 培养液(DMEM),添加 L-谷酰胺 2 mmol/L、10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素及 100 ug/mL 链霉素 聚凝胺: 8 mg/mL HEPES 0.5mol/L,pH 7.1 200uL NaCl(5mol/L) 600uL PCR 试剂
公式中的 PD 代表种群倍增的次数,In 是自然对数 Nstart 是细胞初始接种量,Nfinish 是细胞在传代培养过程中所获得的全部细胞数。
例 2,如果最初种入 2x105 个细胞,培养后可增加至 3.2x106个细胞。以 1:4 的细胞址传代培养 10 次,则:
正义引物 2uL
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注意事项 |
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其他 |
参考转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究
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