小鼠胚胎干细胞培养实验

小鼠

明胶 PBS DMEM 马血清 L-谷氨酰胺 HEPES β-巯基乙醇 PEST LIF

培养板 离心管 水浴锅 离心机 6孔板 24孔板

一、ES培养基
 

在LIF存在的条件下维持细胞培养。
 

二、EB培养基
 

使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
 

1.  分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
 

2.  纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
 

3.  用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
 

4.  一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x10⁶个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
 

5.  2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
 

6.  用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
 

7.  形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
 

三、ITSFn培养基
 

在最少量培养基中选择神经前体细胞
 

1.  胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
 

2.  并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
 

3.  保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
 

4.  观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
 

四、N3培养基＋bFGF
 

通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
 

1.  PBS洗涤，加入1-2 ml 胰酶。
 

2.  37℃孵育5分钟。
 

3.  用4mlEB培养基终止胰酶活*，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
 

4.  将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
 

5.  将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5x10⁵/孔或6孔板1.7x10⁶ /孔。
 

6.  2天后更换培养基。
 

五、N3培养基

通过撤除bFGF使神经前体细胞分化。
 

1.  细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基。
 

2.  根据需要换液（大约每隔一天）。
 

3.  分化10～15天后固定细胞。
 

4.  移除培养基。
 

5.  PBS洗涤，加入4%福尔马林，室温放置30分钟，PBS洗涤2次储存于PBS。

6.  长期储存使用含0.01%叠氮化纳的PBS。
 

六、移植细胞的准备
 

细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10 cm的培养皿。
 

1.  将胚状体转移至一15 ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。
 

2.  去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1xPBS中。
 

2.  离心3分钟。
 

3.  去除上清加入1x胰酶（10 cm的培养皿加1 ml）。
 

4.  37℃水浴5分钟。
 

5.  加入5 mlEB培养基小心吹打约10次。

6.  小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
 

7.  离心2分钟。
 

8.  吸出上清将细胞重悬于500 ul EB培养基。
 

9.  用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次。
 

10.  离心2次。
 

11.  吸出上清将细胞重悬于100 ul EB培养基。
 

七、烟酸己可碱标记ES细胞进行移植
 

1.  准备一10 ug/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）。
 

2.  加入1 mg（你能称到的最小量）到5 ml EB培养基（制成200 ug/ml）。
 

3.  将溶液稀释成10 ug/ml （100 ul  200 ug/ml 溶液和1.9 ml EB培养基）。
 

4.  如前所述将细胞重悬于2 ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液。
 

5.  将悬液置于室温（或冰上）30分钟。
 

6.  离心2分钟。
 

7.  吸出上清将细胞重悬于2 ml EB培养基。
 

8.  重复一次。

9.  离心2分钟。
 

10.  吸出上清将细胞重悬于100 ul EB培养基并置于冰上。

1.需要采用高纯度的水进行培养细胞。

2. 必须要在无菌的环境下操作实验。

1. 在没有添加LIF的条件下，培养在饲养层上的ES细胞克隆形成率和AKP染色阳性度显著高于无饲养层培养的ES细胞。

2. 在LIF添加量达到l000IU/ml时，外源LIF与饲养层产生的基质型LIF在维持未分化状态作用中存在有主从关系。

3. 当没有外源LIF或量不足时，饲养层产生的分化抑制作用才会在分化抑制中发挥主要作用。