DNA的纯化浓缩与定量

实验目的

将复杂的细胞分子混合物加入有机溶媒萃取以除去蛋白质及其它成分，就可以纯化DNA。一般常用酚及氯仿(phenol/chloroform)可使蛋白质变性(denaturaion)的特性来进行萃取的步骤，DNA和RNA不溶于有机溶媒中，而溶于水层。另外，分子选殖(molecular cloning)常利用洋菜胶(agarose)来分离不同大小的DNA片段或用以纯化DNA。

核酸定量可利用核酸会吸收260及280 nm波长的UV光，而且可与荧光染剂ethidium bromide (EtBr)键结，这些物理特性即一般定量DNA的的基本原理。此外亦可藉由UV光的吸收来评估DNA的纯度，若纯化DNA的量足够时，可用光谱分析法定量，当DNA量少或不纯时，才用EtBr键结方法。(注意：EtBr为致癌剂，操作时务必带手套，并禁止戴手套的手到处乱摸!)

溶媒萃取法

1.仪器用具：

(1).桌上型离心机

(2).37℃恒温箱

(3).排烟柜

2.药品及试剂：

(1).phenol/chloroform = 1：1

(2).chloroform/isoamylalcohol = 24：1

(3).RNase A：1mg/ml (100 加热30分钟去除DNase活性)

(4).100% ethanol

(5).TE buffer

3.方法步骤：

(1)由实验1中小量制备的DNA样品，加入RNase A以去除RNA，其终浓度为10-20 mg/ml。

(2)加入50 ml TE buffer混合均匀。

(3)加入100 ml phenol (注意! phenol对皮肤具腐蚀性药品，务必带上手套并在排烟柜中操作)，混合均匀使溶液形成混浊状，这样可以避免震荡及搅拌时所产生的拉力将DNA弄断。

(4)12,000 rpm离心20秒，小心用pipetman把上层液取出到另一离心管。

(5)加入100 ml phenol及100 ml chloroform以萃取刚才收集到的上层液，重复步骤4。

(6)加入200 ml chloroform萃取上层液，并重复步骤4。

浓缩质体DNA

1.仪器用具：

(1).桌上型离心机

(2).真空干燥器

2.药品及试剂：

(1).3 M sodium acetate (NaOAc),pH 5.2

(2).100% ethanol

(3).TE buffer

3.方法步骤:

(1)加入1/10体积的sodium acetate于DNA溶液中，使其最终浓度为0.3 M。

(2)加入2.5倍体积100% Ethanol (EtOH)混合后，置于-20 中30~60分钟(若DNA小于1kb或量少于100 ng/ml，应把溶液放在-70 下2小时，若DNA小于200 bp时，加入10 mM MgCl2 有助于DNA回收。)

(3)12,000 rpm离心10分钟，倒掉上清液，置于真空干燥器10分钟。

(4)加50 ml TE buffer or water，再次悬浮DNA，保存样品DNA于4 。