硝酸还原酶活性的测定实验

实验方法原理：

硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键酶，与作物吸收和利用硝态氮的能力相关。它催化NO3－还原为NO2－的反应：

NO^3－+NADH+H⁺→NO^2－+NAD⁺+H₂O

反应产生的NO^2－可从组织内渗透到外界溶液中，定时测定一定的反应溶液中NO^2－含量的变化情况则可了解此酶的活性大小。NO^2－的定量测定是用磺胺比色法。此法简单易行而又非常灵敏，可测出0.5微克/  ml NaNO₂含量的变化。

试剂、试剂盒：

磷酸缓冲液                                                                 

KNO3溶液                                                                  

磺胺试剂                                                                 

α－萘胺试剂                                                                  

NaNO2标准溶液

仪器、耗材：

721型分光光度计                                                                  

真空泵                                                                  

保温箱                                                                  

天平                                                                  

真空干燥器                                                                  

打孔器                                                                 

三角瓶                                                                 

移液管                                                                 

烧杯   

实验步骤：

一、材料和设备

蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦或棉花的叶片。

721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、打孔器、三角瓶、移液管、烧杯

药品

0.1 M 磷酸缓冲液（pH7.5）

0.2 M KNO3溶液

磺胺（对氨基苯磺酸胺）试剂：1克磺胺溶于25毫升浓盐酸后再用蒸馏水稀释至100 ml 。

α－萘胺试剂：0.2克α萘胺溶于25 ml 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100 ml 。

NaNO2标准溶液：1克NaNO2溶于1000  ml 蒸馏水中配成NaNO2母液。实验时按处理稀释成要求浓度。如1微克/ ml ：取母液1 ml ，用蒸馏水稀释成1000 ml 。

二、实验步骤

1．将新鲜取回的材料叶片用水清洗后用吸水纸吸干水份。用打孔器取下直径为1厘米的园片，再用蒸馏水洗2－3次，将蒸馏水吸干。在天平上称取等重的叶子园片两份：每份0.4克左右（或每份取50个园片）。将两份园片分别置于下列两种溶液中，容器使用50  ml 三角瓶。

（1）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +蒸馏水5 ml 。

（2）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +0.2 M KNO3溶液5 ml 。

将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，使园片沉于瓶底（也可将园片置于注射器中抽气）。将三角瓶置于30℃温箱中（黑暗）保温30分钟，然后分别取两种溶液各1  ml ,准备测定NO2－含量。

（注意取叶前叶片要进行过一段时间的光合作用。若组织中碳水化合物含量降低使此酶的活性降低。当组织内含糖量低时，可在反应液中加入30μ M  3－磷酸甘油醛或1，6－二磷酸果糖，可显著增加NO2－的产生）。

2．绘制标准曲线：磺胺比色法可测出低于1微克/  ml 的NaNO2含量。在0－5微克/  ml 浓度范围内绘制标准曲线。显色反应的速度与重氮化作用的速度及偶联反应的速度相关，因此受温度、酸碱度等影响，也造成灵敏度的变化，若标准样品与测定样品在相同条件下测定，则显色速度也相同，可以作比较。

吸取不同浓度的NaNO2溶液各1 ml 于试管中，（设置NaNO2溶液处理可为5、4、3、2、1、0微克/  ml ）加入磺胺试剂2  ml 及α－萘胺试剂2 ml ，混合摇匀。在30℃温箱中保温30分钟后立即于比色计上比色，用50号滤光片或在520毫微米波长下读取光密度（或透光率）。以NaNO2浓度为横座标、光密度为纵坐标绘制光密度－浓度标曲线。

3．NO2－含量测定：将吸取的测定样品1 ml 置于一试管中，加入磺胺试剂及α－萘胺试剂各2 ml ，混合摇匀，静止30分钟（于30℃温箱中）后立即比色测定：在520毫微米下读取光密度。对比标准曲线，查出NO2－的含量。然后计算酶活性：以每小时每克鲜重产生的NO2－的微摩尔（μM ）值表示。