高效气相色谱仪测定人血浆中硝酸异山梨酯浓度的方法

高效气相色谱仪测定人血浆中硝酸异山梨酯浓度的色谱条件：

1、仪器：高效气相色谱仪

2、检测器：ECD

3、色谱柱：石英毛细管柱 OV-101（25m×0.25 mm I.D.，膜厚 0.22um Shimadzu）

4、载气：高纯氮气

5、载气流速：1.25 mL/min

6、分流比：1：80

7、尾吹气流速：20 mL/min

8、进样口温度：200℃

9、检测器温度：250℃

10、程序升温：起始柱温 150℃，保持 9 min，以 40℃/min 的速率升至 200℃，保持 7mim。

一、血浆样品的提取：

精密量取样品血浆 1 mL，加入内标溶液 40uL，涡旋处理 10s，加乙酸乙酯 5 mL，涡旋处提取 3 min，离心（3500rpm）10 min，取有机相 4.5 mL，于 50℃ 水浴上用氮气流吹干，残渣加乙酸乙酯 50uL 溶解后，精取 2uL 进样。

二、检测器的选择：

1、硝酸异山梨酯气雾剂给药后血药浓度很低，最高血药浓度在 10ng/mL 以下，最低定量限至少应达到 0.1ng/mL，FID 检测器无法满足测定要求。

2、硝酸异山梨酯的结构中含有两个硝酸酯基，硝酸酯基具有限强的亲电性，捕获电子的能力很强，因此在 ECD 上具有很高的响应。

3、ECD 为痕量分析检测器，对亲电性物质的检测响应很高，可以达到纳克级水平，故人血浆中硝酸异山梨酯的浓度测定采用 ECD。

4、载气和尾吹气的流速：ECD 应使用高纯度的氮气，并需经脱氧脱气、分子筛脱水。载气流速主要从组分分离要求确定，尾吹气根据目标峰的峰形、峰面积或峰高和基线来确定。可通过实验确定。

三、色谱柱类型的选择：

1、硝酸异山梨酯气雾剂给药后血药浓度很低，最高血药浓度在 10ng/mL 以下，要求方法有很高的灵敏度。

2、血浆样品较为复杂，干扰物多，要求有很高的分离效果。

3、毛细管柱柱效远远高于填充柱，出峰尖锐，灵敏度高，因此痕量分析中优于填充柱。毛细管柱分离效果远远高于填充柱。故人血浆中硝酸异山梨酯的浓度测定选用毛细管柱。

4、固定相的选择：检测器为 ECD，尽量不要选择含多卤原子的固定相，如甲基三氟丙基聚氧烷（QF-1、OV-210）和聚三氟氯乙烯蜡等。本实验选择了实验室常用的 OV-101 石英毛细管柱。

5、毛细管柱的柱管选择：兼顾柱效和样品容量，选择常规毛细管柱为柱长 25m、内径 0.25 mm 和膜厚 0.22um 的石英毛细管柱。

四、内标的选择：

1、体内药物分析中生物样品的处理很复杂，每一步都有可能导致样品的损失，为校正误差，需在样品处理前加入内标物，一般选择内标法。

2、内标物的选择：本实验选择 3，5-二硝基氯苯。

（1）内标物与目标成分的脂溶性、挥发性、在 OV-101 固定液上色谱保留相似。

（2）3，5-二硝基氯苯含有二个硝基，与硝酸异山梨酯一样在 ECD 上有很高的响应。

五、柱温的选择：

程序升温：起始柱温 150℃，保持 9 min，以 40℃/min 的速率升至 200℃，保持 7 min。

1、选择程序升温：硝酸异山梨酯与内标物 3，5-二硝基氯苯在起始柱温 150℃，保持 9 min 内已出峰，恒温条件可达完全分离，实验显示，样品在目标峰与内标物峰之后仍有血浆中其它物质峰，因此后续升温只是为了洗脱出血浆中其它物质，以便下一次进样分析。

2、程序升温方式的选择：恒温-线性升温-恒温。

理由：起始柱温 150℃，保持 9 min，使硝酸异山梨酯与 3，5-二硝基氯苯在该温度下获得完全分离，然后以仪器允许设置的最大升温速率（40℃/min）将柱温升至 200℃ 并保持 7 min 以洗脱本次进样带入的色谱保留较大其它物质，为下一次进样分析做准备。

六、进样口温度（气化室温度）与检测器温度的选择：

进样口温度 200℃，检测器温度 250℃。

1、进样口温度：200℃ 以上时硝酸异山梨酯破坏较多，200℃ 以下时硝酸异山梨酯气化不完全，故进样口温度设置为 200℃。

2、检测器温度：一般检测器温度与进样口温度相同，但实验显示，250℃ 时 ECD 对硝酸异山梨酯的响应最大，本实验 ECD 温度设置为 250℃。

3、最高柱温：为保护检测器，以防柱中流出物在检测器上凝结，污染检测器，检测器温度至少比柱温高 30℃，即本实验柱温最高可设置到 220℃，并减少维持时间。