聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白

发布时间：2019-12-16 13:38 原文链接：聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白

掌握一种聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的方法，并用此法进一步分析血清蛋白的组成。

1、聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）、NN′-甲叉双丙烯酰胺（Bis），在催化剂过硫酸铵[ammonium persulfate （NH4）2S2O8 简称AP）或核黄素（ribofavin 即vitaminB2，C17H20O6N4）和加速剂N，N， N′，N′-四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-ytetramethyl ethyenediamine，简称TEMEM）的作用下，聚合而成的三维网状结构。

a.目前常用的催化体系：

(1) Ap—TEMED：

① TEMED催化Ap生成硫酸自由基：

S2O82-→2SO4-
　　（过硫酸）　（硫酸自由基）

②硫酸自由基的氧原子激活Acr单体，并形成单体长链：

③Bis将单体长链间连成网状结构：

从反应式中可看出此凝胶是三维网状的，带不活泼的酰胺基侧链的聚合物，没有或很少带有离子侧链，因而凝胶性能稳定，无电渗作用。在碱性条件下，凝胶易聚合，其聚合的速度与Ap浓度平方根成正比。杂质、某些金属离子，低温和氧分子能延长或阻止碳链的延长与聚合作用。用此法聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶。

(1) 核黄素-TEMED：

这是光聚合作用。TEMED可加速凝胶的聚合，但不加也可聚合，光聚合作用通常需要痕量氧原子存在才能发生，核黄素在TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量氧会阻止链长的增加，因此应避免过量氧的存在。

b.凝胶的性质

(1) 机械性能与孔径

T＝（a+b）/m×100% T：凝胶总浓度，a：Acr克数，b：Bis克数，m：缓冲液体积（ml）。

C=b/(a+b)×100% C：交联度

a/b（w/w）与凝胶的机械性密切相关。当a/b<10时凝胶脆而易碎，坚硬呈乳白色；a/b>100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易断裂。预制备完全透明而又有弹性的凝胶应控制a/b=30左右。不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，B.J.Davis的实验发现Acr<2%，Bis<0.5%，凝胶就不能聚合，当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度，通常T为2%～5%时，a/b=20左右；T为5%～10%时，a/b=40左右。T为15%～20%时，a/b＝125～200左右。在研究核酸大分子时，常用T=2.4%大孔凝胶，此时凝胶太软不易操作，最好加入0.5%琼脂糖，有的在3%凝胶中加入20%蔗糖，也可增加其机械强度而不影响其孔径的大小。一般来说，T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大；T浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。

（2）分子量范围与凝胶浓度关系如下表1-2-9

2、电泳原理

（1）浓缩效应

①凝胶孔径不连续；样品胶T=2.5%为大孔胶，分离胶T=7.5%为小孔胶。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢，所以在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

表1-2-9 分子量范围与凝胶浓度的关系

②缓冲体系离子成分及pH值的不连续性（电位梯度不连续性）样品胶和浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl，缓冲液，电极缓冲液为pH8.3的Tris-Gly。HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl^-，而Gly的pI为5.97，所以Gly在样品胶和浓缩胶中解离度很小，仅有1%～0.1%。而有效迁移率＝mα（m为迁移率，α为解离度），所以Cl^-的有效迁移率最快成为快离子，而Gly的有效迁移率最慢成为慢离子，在样品胶和浓缩胶中所选用的pH值必须使有效迁移率满足下述条件：

快离子>样品离子>慢离子。因此在快离子后边形成一个离子浓度低的区域，即：低电导区，又因为E＝I/η（E：电位梯度，η：电导率，I：电流）。低电导率将产生一个高电位梯度，因而在高电压梯度区和低电压梯度区之间，形成一个迅速移动的界面（如图1-2-11）。由于样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间，所以就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄膜。

图1-2-11不连续电泳浓缩效应示意图