共聚焦荧光探针标记方法

（一）BCECF测定pH值

1. 储存液配制 BCECF-AM溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分装后，－20℃避光保存。

2. 染色步骤 将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入BCECF-AM（终浓度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

（二）SNARF-1定量比率测定pH值

1． 储存液配制　SNARF溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分装后，－20℃避光保存。

2． 染色步骤　将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入SNARF-1-AM（终浓度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

（三）Indo-1测定细胞内Ca2+

1． 储存液配制　Indo-1（分子量为840），活细胞标记常选用Indo-1 AM，分子量为1010，呈干粉状，将其溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分装后，避光冷藏保存。

2． 染色步骤　将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入Indo-1 AM（终浓度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。用PBS（含Ca22+、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

也可用弱的去垢剂Pluronic F-127助染。可将Pluronic F-127溶于DMSO配成20%（W/V）的溶液，终浓度1%～2%。

（四）Fluo-3测定细胞内Ca2+

1. 储存液配制　Fluo-3（分子量为855），活细胞标记常选用Fluo-3 AM，分子量为1130，呈橙色粉状，避光冷藏保存或将其溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分装后，避光冷藏。

2. 染色步骤 将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入Fluo-3 AM（终浓度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

可用Pluronic F-127助染。方法同上。

（五）CFDA测定细胞间通讯

1．储存液配制 CFDA即5-（6）-羧基荧光黄乙酰乙酸盐（5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate ，5(6)-CFDA），分子量为460.40，用乙醇或DMSO配成10mg/ml溶液，等份分装后，避光冷藏。

2． 染色步骤 将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入CFDA溶液（终浓度10-20ug/ml），37℃孵育10～15min。用PBS（含Ca2++、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

（六）DiBAC4测定细胞膜电位染色步骤

1． 培养细胞用DiBAC4孵育，37℃，10～20min，终浓度2～5μmol/L。

2． 激光扫描共聚焦显微镜观察，实验中注意将细胞内外的DiBAC4浓度保持一致。如果细胞去极化，如增加溶液的KCl浓度10～15μmol/L，DiBAC4荧光强度增强。

（七）Rhodamine 123标记活细胞线粒体染色步骤

培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍加入Rhodamine 123溶液（终浓度1μg/ml），37℃孵育10～30min用PBS冲洗2遍激光扫描共聚焦显微镜观察。

（八）AO显示RNA和DNA染色步骤

培养细胞用95%酒精固定10～15min，干燥。1%醋酸酸化30s。0.01%AO染色5～10min。PBS（pH 4.8）洗1min。0.1mol/L CaCl2分化30s或用水洗数分钟。激光扫描共聚焦显微镜观察。

（九）PI显示DNA染色步骤

培养细胞用PBS洗2遍，离心。弃上清液留0.5ml，用PBS将细胞密度调整为1×106/ml。加入浓度为5mg/50ml的 RNAase   0.5ml， 37℃消化30min。取出放入冰浴中，加入浓度为5mg/100ml的PI  1.5ml ， 染色至少30min。300目尼龙网过滤。共聚焦显微镜观察。

思 考 题

1． 试述激光扫描共聚焦显微镜的基本原理及主要功能。

2． 如何选择共聚焦激光扫描显微镜的荧光探针？

3． 设计一个用Fluo-3测定细胞内Ca2+的实验程序。