外泌体miRNA或将更适合结肠癌早期诊断

　　结肠直肠癌（CRC）是全球诊断率排名第三的消化道恶性肿瘤。2018年，约有881，000人死于CRC。据统计，超过70％的CRC位于结肠，也就是结肠癌（CC）。CC在北美、欧洲和澳大利亚等地区的发病率和死亡率非常高。近年来，亚洲国家CC的发病率也逐年递增，CC的诊断和治疗已成为全球关注的热点问题。

　　早期CC患者可以通过手术等手段得到治疗，5年生存率已超过90%，但晚期CC患者的中位生存期不到2年。显然，CC的早期诊断有利于提高患者的生存率，改善临床治疗结果。但到目前为止，除了内窥镜检查，几乎没有其他任何方法可用于CC的早期诊断。大多数CC筛查仅根据参与者的年龄、性别以及其他流行病学因素进行初步诊断，导致筛查的依从性低和医疗资源大量浪费。因此，临床迫切需要一种侵入性小且易操作的CC早期诊断替代方法。

　　目前，液体活检已经成为癌症早期诊断的重要研究方向。miRNAs能够通过转录后调节来控制基因表达，在胚胎发育、癌症发生、免疫调节和其他生物过程中起着至关重要的作用。已有研究表明，血浆、血清和尿液中的循环miRNA有作为癌症和其他疾病的无创生物标志物的潜力。

　　循环miRNA来源于癌细胞、成纤维细胞、凋亡细胞甚至坏死细胞，且具有高度异质性。但目前对循环miRNA的生物学功能仍知之甚少，这在很大程度上限制了其作为生物标志物的应用潜力。miRNA的另一个重要来源是外泌体——小细胞外囊泡（sEV）。sEV的膜可以有效地保护内部miRNA免受RNase的影响，从而使得sEVs衍生的miRNA比血液等体液中的循环miRNA更可靠。多项研究显示，小细胞外囊泡（sEV）在多种疾病的早期检测中有着重要作用，但对于sEV衍生miRNA作为早期CC特异生物标志物的系统筛选尚未有报道。

　　近日，由首都医科大学附属北京友谊医院消化分中心团队与北京恩泽康泰团队合作的研究成果发表在国际外泌体顶级期刊Journal of Extracellular Vesicles（IF=11）。该研究首次报道了早期结肠癌患者血浆外泌体的miRNA图谱，开发了可高效识别早期结肠癌的外泌体液体活检方案，并发现外泌体miRNA比血浆游离miRNA更适合消化道早期癌症诊断，可以作为CC早期诊断的一种潜在生物标志物。

　　为对早期结肠癌的特异性血浆sEVs标志物进行系统性的筛选和验证，该研究团队以血浆sEVs-miRNAs作为早期结肠癌标志物，从miRNA特征鉴定、差异miRNAs筛选、标志物筛选及验证、标志物在早期结肠癌中的验证、诊断性能比较等方面，系统对比分析了CC患者和正常对照（NC）血浆总miRNAs。

　　1. sEVs的特征鉴定

　　利用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析技术（NTA）和蛋白质印迹法（WB），研究人员对来自15名CC患者和10名正常对照的sEVs进行了表征分析。初步研究结果显示，经血浆总RNA归一后，CC患者和NC的sEVs RNA浓度、血浆总RNA浓度以及sEVs RNA在百分比方面均无显着差异（图1）。

　　2. CC患者和NC血浆中sEVs差异miRNAs的筛选

　　同时，研究人员还对血浆sEVs进行了miRNA测序及差异miRNA分析（图2）。结果显示，有60个差异表达miRNA（DEMs）与TCGA数据库有重叠，且每个DEM在sEVs和TCGA中有着相似的灵敏度和特异性。这60个DEMs对应的靶基因涉及细胞骨架、细胞迁移、ATP结合、生物合成等功能以及癌症相关通路。

　　3. 结肠癌相关sEVs miRNAs标志物筛选及验证

　　基于上述60个DEMs，研究人员从已报道的结直肠癌标志物中筛选出4个候选miRNA标志物：let-7b-3p、miR-150-3p、miR-145-3p和miR-139-3p。此外，研究人员在RNA提取前进行了蛋白酶K和RNase的消化验证（图3）。研究结果显示，4种标志物在sEVs中未降解，而在血浆中经酶消化后部分降解；阳性对照miR-21-5p和miR-30a-5p（已知的RNP相关miRNA）在相同处理下几乎完全降解，表明候选miRNAs在sEVs中受到sEVs膜的保护。

　　在结肠癌早期诊断的验证试验中，研究人员利用RT-qPCR方法在134例样本（58例CC，76例NC）中验证了sEVs来源的let-7b-3p、miR-150-3p、miR-145-3p和miR-139-3p的诊断性能（图4）。研究数据显示，四个miRNA的曲线下面积（the area under the ROC curve，AUC）分别为0.792、0.686、0.692和0.679。经过进一步逻辑回归模型分析，let-7b-3p、miR-145-3p和miR-139-3p的组合AUC可高达0.927。

　　4. miRNA诊断性能比较

　　sEVs中的miRNA是血浆总miRNA的一部分，为研究sEVs来源miRNA作为生物标志物的必要性，该研究对比分析了sEVs来源miRNA和血浆总miRNA中候选标志物的诊断性能（图5）。结果显示，与血浆总miRNA相比，sEVs来源miRNA有着更高的AUC和诊断潜能。对比多个miRNA panels，分离后的sEVs miRNA在早期CC患者的识别、诊断中有着非常明显的优势。