1. eccDNA成环的整体统eccDNA测序结果充分体现了基因组水平成环的多样性。eccDNA来源十分丰富，同一个基因有可能会产生非常多的环状，同样一个环状也不仅仅只会包含一个外显子。TTN基因就是一个非常典型的例子。该基因长度达到了0.3Mb，而这样一个基因竟然能衍生得到130个eccDNA，是一个经典的编码基因区域成环的案例。其中比较有代表性的是43-66以及44-52号外显子所组成的环状分子。eccDNA测序的目的正是在组学的层面上全面的描述刻画eccDNA的成环多种可能性。
图1 来源于TNN基因的两例eccDNA
2.eccDNA长度分布与来源探索
eccDNA是环状结构，这样一种分子的长度分布如何？测序结果显示99%的eccDNA长度小于25Kb，其中仅有占比约1%的分子大于25Kb。在这99% 当中，在0.1Kb以及5Kb处有富集峰，这表明该区段的eccDNA占绝大多数。经典的知识体系告诉我们重复序列以及5sRNA部分最容易成环，事实上测序结果也充分证明这一点，SINE（3.1%）、LINE（3.5%），中心粒（2.0%），以及sRNA（8.1%）部分是最经典的成环结构，大量的环能够匹配到这些区域。
图2 eccDNA长度分布和来源多样性
3.eccDNA基因组分布
前文提到99% eccDNA小于25Kb，作者分别探索这些eccDNA来源于哪些染色体。结果显示所有染色体对eccDNA都有所贡献。其中小于25Kb部分的环状在染色体上的分布相对密集。
图3 eccDNA的染色体分布
4. eccDNA形成的基因偏好性
既然每一条染色体都有可能成环，都对eccDNA多样性产生巨大贡献，那eccDNA产生是否有一定的偏好性呢？文章测序结果显示17和19号染色体成环的可能性最大，由于17号染色体有相对多的编码基因，研究者猜测成环的可能性可能与编码基因数目呈正相关。
图4 17号与19号染色体对eccDNA贡献最大
5. eccDNA具有转录活性
eccDNA能够高效扩增成环序列，这种扩增是否有转录活性？RNA转录本是否仅仅来源于传统线性的染色体？要回答这一问题，作者通过RNA-seq（云序提供该服务）进行探索，结果发现split-reads，即在RNA-seq测序的结果当中同样发现了能够跨过相同剪切位点的测序片段，这种片段的剪切位点和eccDNA成环的剪切位点序列保持一致，说明环形的eccDNA也具有转录活性，这一点非常重要，这很有可能造成成环基因（尤其原癌基因和耐药基因）在转录本水平的明显高表达从而进一步促进癌症的发生发展，是非常具有临床意义的研究成果。
图5 HIP1形成eccDNA具有转录活性
6. eccDNA成环验证
类比于经典的circRNA，eccDNA的形成具有相似性，也是经过核酸序列的反式链接得到的产物。当然有关于成环机制的问题依然还需要大量的研究讨论。不过对于环状的结构验证可以模仿circRNA，针对junction site，就是链接位点设计发散引物（divergent primer）同时设计收敛引物（convergent primer）进行PCR扩增，然后通过Sanger测序的方式验证eccDNA的接头序列。
图6 eccDNA的验证
总结
从eccDNA全新视角理解生物过程的发生发展，这篇Nature Communication文章提供了最好的参照。研究者在进行eccDNA-seq之后对高通量数据进行整理归纳，从eccDNA的个数、长度、来源、分布和基因相关性进行深入分析，造就一篇10分以上“表达谱”的文章。这将会是一个契机，通过快速的eccDNA-seq结合PCR方式率先用“谱”的方式快速阐述一个疾病当中哪些基因易于成环、哪些基因扩增效率更高并快速和疾病的发生发展建立联系，有理由相信这种虽然简单但是高度创新的文章一定会备受瞩目，影响因子再创新高。
eccDNA以颠覆传统认知的方式重新走到科研舞台的中心，必将在未来的一段时间掀起一场有关基因扩增、转录的大讨论。我们已经习惯了观察基因的缺失、突变、插入和移位，eccDNA的产生从新的角度让科研工作者去思考基因组存在的动态性和多样性。由此，肿瘤的异质性、肿瘤微环境、液体活检和耐药性等相关研究必定会围绕eccDNA展开更多集中式的研究和探索，有理由相信这次2019年年末的Nature和Cell文章的发表将成为里程碑式的作品，引领未来三到五年内有关eccDNA研究的新方向。