刘默芳组：LARP7介导U6修饰及在生精细胞mRNA精准剪接功能

　　在较高等的真核生物中，大部分基因都含有内含子，在转录完成后需经过剪接（splicing）从mRNA前体移除内含子，以产生成熟、有翻译活性的mRNA，这个过程由剪接体（spliceosome）催化完成。经典的剪接体包括五种snRNA（small nuclear RNA），即U1、U2、U4、U5和U6及与它们相互作用的蛋白因子【1】。其中，U6 snRNA处于核心地位，其保守性最强，且位于剪接体催化中心、为剪接体催化活性必需【2】。同时还发现，U6在后生动物中被高度修饰，包括末端的5 γ-单甲基化加帽和3 寡聚尿嘧啶化修饰，中间的2-O-甲基化、假尿嘧啶、m2G和m6A修饰等【3,4】。经过近40年的研究，研究者虽然已较为全面地揭示了U6生物生成的过程及其在剪接中的功能机制，但目前对U6修饰的调控机制及其在mRNA剪接中的功能还不甚了解。

　　之前的研究发现，在哺乳动物成年个体中，睾丸是转录活性最高、可变剪接最为丰富的组织【5】，暗示睾丸的RNA剪接机器可能以高活性存在。与之一致的是，精子发生受时空特异性表达的基因调控，生精细胞发育的各个阶段都有特异的基因调控和信号转导相关的基因发生可变剪接。因此，睾丸组织应该是研究哺乳动物U6修饰及其在mRNA剪接中功能的理想系统。

　　2020年2月3日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）刘默芳研究组在Molecular Cell杂志上发表了文章LARP7-Mediated U6 snRNA Modification Ensures Splicing Fidelity and Spermatogenesis in Mice，报道了RNA结合蛋白LARP7通过促进U6 snRNA与具有RNA甲基化催化活性的box C/D snoRNP相互作用，介导了U6的2-O-甲基化修饰，并进一步证明此过程为小鼠生精细胞中mRNA剪接保真性及精子发生必需。

　　在该研究中，刘默芳研究组博士后王鑫、博士研究生李智彤、闫越等以小鼠睾丸为研究系统，探索了U6 snRNA修饰的调控机制及其在mRNA剪接中的功能。他们发现，在睾丸高表达的LARP7蛋白对生精细胞中U6的2-O-甲基化修饰至关重要。已有研究发现RNA结合蛋白LARP7通过与7SK RNA结合，抑制RNA聚合酶II转录延伸【6,7】，还有研究发现Larp7基因突变与人类Alazami综合征相关【8】。进一步的机制研究揭示，LARP7同时结合U6和snoRNA，协助U6装载到box C/D snoRNP上，进而促使box C/D snoRNP中的甲基转移酶FBL对其进行2-O-甲基化修饰。更重要的是，他们发现LARP7介导的U6 2-O-甲基化修饰对小鼠生精细胞中的mRNA精确及精子发生至关重要，在生殖细胞条件性敲除Larp7基因致小鼠雄性不育。此项研究揭示了U6 snRNA修饰的调控机制，并首次证明U6 2-O-甲基化修饰对哺乳动物mRNA的精准剪接及精子发生至关重要。

　　另外，德国雷根斯堡大学Gunter Meister研究组、维尔茨堡大学Utz Fischer研究组还与刘默芳研究组合作，“背靠背”发表了论文The Alazami Syndrome-associated Protein LARP7 Guides U6 small nuclear RNA Modification and Contributes to Splicing Robustness，报道了人细胞中LARP7也能通过结合U6和snoRNA，介导U6的2-O-甲基化修饰。更重要的是，在一例携带有Larp7突变的Alazami综合症患者样本中，他们检测到了U6的2-O-甲基化修饰变少和mRNA剪接异常。这两项“背靠背”的研究工作共同证明，在哺乳动物中LARP7介导U6修饰并影响mRNA精准剪接，不仅揭示了U6修饰的调控机制及其在mRNA剪接中的功能，还将有助于解析男性不育、Alazami综合征等的致病机理，并为相关疾病的诊断治疗提供理论依据和方法技术。

　　参考文献

　　1. Patel, A.A., and Steitz, J.A. (2003). Splicing double: insights from the second spliceosome. Nat Rev Mol Cell Bio 4, 960-970.

　　2. Didychuk, A.L., Butcher, S.E., and Brow, D.A. (2018). The life of U6 small nuclear RNA, from cradle to grave. RNA 24, 437-460.

　　3. Epstein, P., Reddy, R., Henning, D., and Busch, H. (1980). The nucleotide sequence of nuclear U6 (4.7 S) RNA. J Biol Chem 255, 8901-8906.

　　4. Harada, F., Kato, N., and Nishimura, S. (1980). The nucleotide sequence of nuclear 4.8S RNA of mouse cells. Biochem Biophys Res Commun 95, 1332-1340.

　　5. White-Cooper, H., and Davidson, I. (2011). Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harb Perspect Biol 3 a002626.

　　6. Krueger, B.J., Jeronimo, C., Roy, B.B., Bouchard, A., Barrandon, C., Byers, S.A., Searcey, C.E., Cooper, J.J., Bensaude, O., and Cohen, E.A., et al. (2008). LARP7 is a stable component of the 7SK snRNP while P-TEFb, HEXIM1 and hnRNP A1 are reversibly associated. Nucleic Acids Res 36, 2219-2229.

　　7. Markert, A., Grimm, M., Martinez, J., Wiesner, J., Meyerhans, A., Meyuhas, O., Sickmann, A., and Fischer, U. (2008). The La-related protein LARP7 is a component of the 7SK ribonucleoprotein and affects transcription of cellular and viral polymerase II genes. EMBO Rep 9, 569-575.

　　8. Alazami, A.M., Al-Owain, M., Alzahrani, F., Shuaib, T., Al-Shamrani, H., Al-Falki, Y.H., Al-Qahtani, S.M., Alsheddi, T., Colak, D., and Alkuraya, F.S. (2012). Loss of function mutation in LARP7, chaperone of 7SK ncRNA, causes a syndrome of facial dysmorphism, intellectual disability, and primordial dwarfism. Hum Mutat 33, 1429-1434.