萜类化合物的色谱法制备分离

萜烯简称萜，是一系列萜类化合物的总称，是分子式为异戊二烯的整数倍的烯烃类化合物。萜烯是一类广泛存在于植物体内的天然来源碳氢化合物，可从许多植物，特别是针叶树得到。它是树脂以及由树脂而来的松节油的主要成分。根据近年来的研究，除了在植物中大量存在萜类化合物外，在海洋生物体内也提取出了大量的萜类化合物，据统计，很多萜类化合物具有重要的生理活性，是研究天然产物和开发新药的重要来源。

实验所用萜类化合物样品中含有双顺和双反两种异构体，通常都是使用两个异构体的混合物直接入药，极少将其分离成单体。样品中含有未知杂质极易污染填料导致正相填料分离效果丧失，填料寿命低，分离成本极高，产生大量固废。另一方面该样品对水敏感，流动相建议用水量不超过3%，所以反相填料分离也有局限。经过填料筛选实验最终确定silica是最合适的填料，方法中涉及样品预处理，浓缩后再进行制备，过程极为繁琐，耗时极长，需要一种简洁快速的制备方式。

本实验选用天津博纳艾杰尔科技多级色谱制备纯化系统和硅胶填料，集合预处理、浓缩和制备于一体，可以快速制备萜类化合物样品中的两个异构体，方法简单快速，只需要一次进样操作即可得到目标物。方法也解决了填料寿命问题。

图1 实验流程图

二.实验方法

2.1实验用品

• 乙醇;

• 甲醇;

• 水：超纯水;

• 正己烷;

• 液相色谱柱：Promosil C18 (5 μm，100 Å，4.6*250 mm);

• 液相色谱柱：Venusil^® XBP Silica(5 μm，100 Å，4.6*250 mm);

• 液相色谱柱：Venusil^® HILIC(5 μm，100 Å，4.6*250 mm);

• 中压色谱柱：Claricep FLASH silica(20-45 µm，100 Å，12 g);

• 中压色谱柱：Claricep FLASH silica(40-60 µm，60 Å，80 g);

• 中压色谱柱：Claricep FLASH silica(20 µm，100 Å，20 g);

• 液相色谱柱：Venusil^® XBP Silica(5 μm，100 Å，2.1*50 mm);

• 制备仪器：多级色谱纯化系统;

•l 分析仪器：LC-10F。

• 中压仪器：CHEETAH^® MP 200

2.2样品溶解

样品为淡黄色液体，取200 μL样品，加入1 mL乙醇超声溶解。

2.3实验步骤

2.3.1多级色谱制备方法

①一级上样系统

色谱柱：Claricep FLASH silica(40-60 µm，60 Å，80 g);

流 速：40 mL /min;

进样量：1 mL原样品;

波 长：205/254 nm;

流动相：正己烷

色谱图：

图2 一级色谱上样系统制备图

收集将4-5 min流出液。

②二级上样系统

将上步得到的接收液泵入富集小柱中并通过二级快检系统检测直至有峰出现则停止二级上样系统，此时小柱已富集完成。

色谱柱：Claricep FLASH silica(20 µm，100 Å);

流 速：5 mL /min;

色谱图：

图3 二级色谱快检富集色谱图

③二级快检系统

色谱柱：Venusil^® XBP Silica(5 μm，100 Å，2.1*50 mm);

流 速：0.3 mL /min;

波 长：205 nm;

进样量：10 μL富集小柱柱后流出液;

梯流动相：正己烷

④二级输液系统

二级上样结束后，开启二级输液系统开始讲富集小柱中样品，洗脱下来泵入三级分离系统中色谱柱中，二级快检系统检测图谱无峰时停止洗脱开启三级分离系统。

流 速：5 mL /min;

流动相：正己烷：乙醇=9:1

图4 二级色谱快检输液色谱图

⑤三级分离系统

色谱柱：Claricep FLASH silica(20 µm，100 Å，20 g，四支串联);

流 速：15 mL /min;

波 长：205/254 nm;

流动相：正己烷

色谱图：

图5 三级色谱制备图

分别收集32 min和34 min两峰接收液,并使用正相检测条件检测纯度。

2.3.2制备产品检测条件

色谱柱：Venusil^® XBP Silica(5 μm，100 Å，4.6*250 mm);

流 速：1 mL /min;

进样量：20 μL;

波 长：205 nm;

流动相：正己烷

色谱图：

图6 32 min馏分检测色谱图

图7 34 min馏分检测色谱图

图8 样品检测色谱图

三.结果与讨论

3.1前期方法优化实验：填料筛选

①色谱柱：Promosil C18(5 μm，100 Å，4.6*250 mm);

流 速：1.0 mL /min;

进样量：5 μL;

波 长：205 nm;

流动相：水：甲醇=5:95

色谱图：

图9 反相分析色谱图

②色谱柱：Venusil^® XBP Silica(5 μm，100 Å，4.6*250 mm);

流 速：1.0 mL /min;

进样量：5 μL;

波 长：205 nm;

流动相：正己烷

色谱图：

图10 silica分析色谱图

③色谱柱：Venusil^® HILIC(5 μm，100 Å，4.6*250 mm);

流 速：1.5 mL /min;

进样量：5 μL;

波 长：205 nm;

流动相：正己烷

色谱图：

图11 hilic分析色谱图

小结：

1)由于样品对水不稳定，如流动相需要加水不易超过3%，该样品不适合使用反相填料分离，且在反相上分离度不高。Hilic填料分离度差峰拖尾严重，只有silica填料是最适合的填料。

2)考虑成本问题，尝试使用大粒径填料分离，并且添加保护柱来延长填料寿命。

3.2前期制备方法优化：中压制备

色谱柱：Claricep FLASH silica(20-45 µm，100 Å，12 g，三支串联);

流 速：6 mL /min;

进样量：200 μL;

波 长：205/280 nm;

流动相：正己烷

色谱图：

图12 中压制备色谱图

小结：

1)样品可以使用silica 20-45 µm中压填料分离异构体。

2)由于样品中含有双顺和双反两种异构体，并含有较大极性的杂质，此杂质在正相条件下无法冲出会吸附在硅胶填料上，在经过多次上样后会污染硅胶填料，柱效逐渐下降，再结合成本问题，因此采用多级色谱制备方法。

3.3结果

经过填料筛选及中压制备方法摸索最终确定以silica中压填料为基质的多级分离方法，可以有效分离该样品中的两个异构体。

3.4讨论

• 由于样品中含有强保留杂质会污染silica填料使填料活性丧失，故实验需要首先过一遍硅胶柱除掉此类杂质(次硅胶柱可重复使用)然后再使用falsh silica柱分离，这样可以提高flash柱的使用寿命。

• 使用多级色谱简化了操作过程，缩短单次分离时间，提高效率。

四.结论

实验结果表明，采用天津博纳艾杰尔科技有限公司多级色谱纯化系统结合硅胶填料，可以有效快速分离该萜类化合物双顺和双反异构体的混合物，该方法更有效、更快捷、更准确。