蛋白质检测的捷径

图1.  蛋白是由氨基酸构成的大分子。

在药品的质量检测过程中，常常要对不同产品的总蛋白质含量进行测定。TOC/TNb总有机碳（总氮）分析作为一种热催化分解技术，由于只需要很短的检测时间，并省略了一系列检验样品的制备工作等因素，具有重要的应用前景。

在医药工业领域，质量管理人员经常要对原料、半成品和成品的蛋白质含量进行检测。对于这种检测，目前已经有许多可以选用的检测方法了。仅在欧洲药典（ph. Eur. 2.5.33）中，就规定了6种基于不同反应原理和检测原理的蛋白质含量检测方法。这些方法可以粗略划分为：酚试剂法、考马斯亮蓝法、蛋白质定量试剂盒BCA法和双缩脲法。它们都是以特定氨基酸残基不同的染色反应为基础，通过测定可见光谱范围内特定波长的吸收率来确定蛋白质含量的方法。另外，标准中还规定了一种紫外线吸收法、一种荧光分析法和两种通过检测氮含量来推断的方法。

蛋白质是氨基酸构成的大分子物质，是动物和植物细胞的基本组织。由100多个氨基酸构成的氨基酸链通常也称之为“肽”或者“缩氨酸”。许多蛋白质，例如病毒和抗体（免疫球蛋白），实际是蛋白质复合物，是将一个个蛋白质经氢键、离子键或者二硫键相互连接起来的。

所有这些连接都有一个共同的特点：它们都含有大量的氮原子。用总氮分析可测得其总量通常涉及两种方法，一种是利用硫酸进行测定的基耶达尔法；另一种是DIN EN 12260标准介绍的在氧气中高温燃烧的催化检测法。

图2.  Multi N/C 2011 S型TOC/TNb分析仪。

总氮检测方法

在测定含有蛋白质的溶液或者悬浮液的含氮量时，由于可供检验的样本量很少，常常需要采用直接在样本中注入并完成检测的方法。当注射量为50~100ml时，样本量少于100ml的样本足够完成多次检验测定了。

按照过去15年来DIN EN 12260标准规定的水基样本总氮（TNb）检测方法，在样本制备时，现代化的催化器应保证燃烧温度高于700℃。经过这种所谓的热催化分解之后，将从样本中催化出大部分氮化合物和一小部分高氧化的氮化合物。在加入运载气流之后，产生的NO（一氧化氮）被运送到化学荧光分析仪（CLD）。其中，NO与CLD中的O3开始发生化学反应，产生能量活跃的NO2（二氧化氮）。与常规化学反应一样，性质活跃的NO2在光电倍增管射线的照射下回到NO2的基态，反应如下：

这种方法适合于对任何含氮化合物的总氮数据进行检测，而不是对分子氮（N2）的含量进行检测。也就是说：在这种蛋白质检测方法中，无机氮化合物以及有机的非蛋白原的氮化合物的存在能够成为干扰。但这种总氮检测方法却因省略了所有的样本制备，只需通过3~5min的检测时间即可完成。

利用Analytik Jena公司研发生产的Multi N/C 2100 S型蛋白质含量分析仪，可以高效、自动地在各种液体样本中测定蛋白质的含量；同时还可以完成TOC、TIC和TC等参数的检测。

Multi N/C 2100 S是一台在液体样本中直接注入并检测TOC/TNb总碳（总氮）的检测仪，带有高温燃烧的催化装置和石英玻璃烧管。Multi N/C 2100 S使用100、250或者500μl等不同规格的直接注入器，结合使用2ml或者8ml的自动进样器架，能够完成各种不同的蛋白质含量检测任务。即便是含有颗粒的悬浮液，也可以使用大内径小管以及标准的样本摇匀、磁力采样等方法进行精确的蛋白质含量检测。由于采用直接注入的方法，因此该分析检测仪的检测精度与所使用的注入器小管直径无关，能够得到准确性很高的、良好可重复性的检测结果。在目前使用铂催化剂、利用合成气体为载体的情况下，通常的催化燃烧温度为800℃。

图3.  某免疫疫苗的TN总氮检测曲线。

该分析仪的测量范围在0.1~200μg/ml总氮之间，检测的灵敏性可与最灵敏的BCA法（0.1~200μg/ml蛋白质）相比较。

在这种蛋白质测定方法中，最具有决定性的一点是测定方法的标定以及将样本中检测到的总氮换算成蛋白质含量总量。一般来讲，建议用多种方法进行标定，也就是说：在含蛋白质溶液的TN总氮测定时，也采用标准的蛋白质标定方法。这样就会得出铵基-硝酸盐混合标准标定方法与标准规定之间的差异。

在利用这种总氮检测方法对免疫疫苗的检测分析中，所使用的牛血清白蛋白的指定含氮量为15.87％，纯度大于98％。该牛血清白蛋白标准样本中氮含量换算的因子为6.30。

在有关技术资料、文献中，常用的氮浓度换算因子一般为6.25：蛋白质含量[mg/ml]＝氮因子（6.25）×TN含量[mg/ml]。

在所进行的一系列试验中，除了将牛血清白蛋白溶液作为检验标准以外，还有水质高免血清1-3，IgG浓度8.3mg/ml的兔血清作为参考标准（参见图4）。它们按照蛋白质换算因子6.25换算后的氮含量为1.328mg/ml。标准溶液的稀释与检验标准无关。

图4.  利用BSA标准对2.5~20mg/L的TNb总氮样本进行多点标定。

在附表中汇总了各种不同免疫疫苗的检测结果。这些检测结果是对200μl样本5倍直接注入后检测的结果。

小结

利用TNb总氮分析仪可以按照DIN EN 12260标准对蛋白质含量进行分析检测。利用这一方法，可以取代工作量大而重复性差的、且易受干扰的蛋白质检测分析方法，实现快速、可靠和自动化的蛋白质分析检测。

这种分析检测方法能获得宽的线性检测范围、高灵敏度和选择性，并省略了样本制备的准备工作，从而也明显地降低了检测结果的人为干扰因素。

这种方法是欧洲药典中规定的一种检测分析方法，相比较而言也是非常简单的一种方法。原本一些可能产生的干扰性因素，例如有机氮或者非蛋白质的无机氮化合物等会给许多蛋白质分析检测方法带来干扰，如今也都因为蛋白质的沉淀和分离而不再成为影响因素了。

利用总有机碳（总氮）分析确定蛋白质含量

总有机碳（总氮）TOC/TNb分析法是利用在氧中高温燃烧催化的方法检测样本中总氮含量，从而测定蛋白质含量的方法。这种方法是欧洲药典中规定的方法，能够得到良好可重复性的检测结果，并且易于实现自动化检测。它的优势在于：

直接在样本中进行操作，无需样本制备。不足100ml的样本足以完成多次测定；

检测时间短，每个样本的检测时间为3~5min；

在较宽的线性检测范围内可准确地、选择性地进行检测。