新型离子交换柱应用归纳

图1.  不同粒度填料在不同流速下的压力对比。色谱条件：柱尺寸，4.6mm ID× 3.5cm；流动相，20mmol/L Tris-HCl（pH8.5）。

本文实验通过对蛋白、核苷酸等样品分离，考察了新型无孔离子交换色谱柱的分离性能。结果表明，该类色谱柱可以在较低的柱压下实现对各种生物样品的高分辨、高通量分析和痕量制备。

随着生物制药行业的快速发展，对生物样品高通量、高分辨率的分离需求变得越来越急迫。针对这一需求，东曹公司开发了新型可用于生物样品高分离、快速分析的无孔离子交换色谱柱—TSKgel STAT系列色谱柱。本文通过一系列样品分析实验考察了该系列色谱柱的性能。样品类型包括PCR产物、PEG化β-乳球蛋白、单克隆抗体、核苷酸等生物样品。

图2.  样品上样量依存关系比较。色谱条件：柱尺寸，4.6mm ID×3.5cm；流动相，A为20mmol/L Tris-HCl（pH8.5），B为0.5mol/ L Tris–H~100%（10min.）；样品，1为伴白蛋白，2为卵清蛋白；检测，紫外280nm。

实验部分

仪器和主要试剂

HLC 8020高效液相色谱仪（日本Tosoh），Tris-HCl、NaCl等其他试剂均为AR级。色谱柱为TSK-GEL STAT系列色谱柱（日本Tosoh）。

图3.  PCR产物色谱图和电泳图。色谱条件：色谱柱，TSKgel Q-STAT 4.6mm ID×3.5cm (10μm) ；流动相，A为20mmol/L Tris-HCl（pH8.5），B为1.0mol/L NaCl in A（pH8.5）；梯度，B为0% ~100%（1.5min）；流速，2.0 ml/min；检测波长， UV 260nm。

结果与讨论

压力与样品载量考察

实验对比考察了TSKgel Q-STAT系列色谱柱与以前开发的TSKgel DEAE-NPR（2.5μm）色谱柱的流速与柱压、上样量的依存关系，实验结果见图1和图2 。结果表明，在相同流速下，TSKgel Q-STAT系列色谱柱较以前的无孔离子交换色谱柱TSKgel DEAE-NPR，柱压降明显降低。在进样量范围内，随着进样量的提高，分离度未有明显降低。新开发的TSKgel Q-STAT系列色谱柱的上样量较TSKgel DEAE-NPR色谱柱有显著提高。

图4.  β-乳球蛋白的PEG化过程监测色谱图。

PCR产物的分离纯化

采用强阳离子交换色谱柱TSKgel Q-STAT对核酸样品的PCR产物进行了分离制备，收集PCR产物馏分并采用琼脂糖凝胶电泳进行了分析，分析结果见图3。实验结果表明，该色谱柱可以在2min内完成样品分析和痕量制备，满足电泳分析对样品量的需要。

PEG化β-乳球蛋白的分离）

采用强阳离子交换色谱柱TSKgel SP-STAT对β-乳球蛋白的PEG化过程进行监测，分析结果见图4。实验结果表明，该色谱柱可以在2min内完成分析，实现对β-乳球蛋白PEG化过程每5min进行1次监测。

图5.  单克隆抗体电荷异构体的分离色谱图。色谱条件：色谱柱，TSKgel CM-STAT, 4.6mm ID×10cm（7μm）；流动相，A为20mmol/L MES buffer （pH6.0），B为0.1mol/L NaCl in A （pH6.0）；梯度条件，B为20%~50%（30min）；样品，MAb样本；流速，1.0ml/min；检测波长，UV 280nm。

色谱条件：色谱柱，TSKgel SP-STAT, 4.6mm ID x 3.5cm（10μm） ；流动相，A为20mmol/L Na acetate buffer（pH4.5），B为0.8mol/L NaClO4 in A（pH4.5）；梯度条件，B为0~30%（2min，线性）；流速，4.0ml/min；分析间隔时间，5min。

单克隆抗体的分析

采用弱阳离子交换色谱柱TSKgel CM-STAT对单克隆抗体样品进行了分离，分析结果见图5。实验结果表明，在SDS-PAGE上无法实现分离的单克隆抗体电荷异构体样品可以在该色谱柱上实现很好的分离。

图6.  核酸样品的分离色谱图。色谱条件：色谱柱，TSKgel DNA-STAT 4.6mmID×10cm （5μm） , DNA-NPR 4.6mm ID×7.5cm；流动相，A为20mmol/L Tris-HCl （pH8.5），B为1.0mol/L NaCl （pH8.5）；梯度条件， B为50%~75% （20min） for DNA-NPR，75%~100% （20min） for TSKgel DNA-STAT；样品，DNA 1kb Ladder；流速，0.5ml/min；检测波长，UV 260nm。

核酸样品的分离

实验采用核酸样品（1kb DNA Ladder）对比考察了TSKgel DNA-STAT色谱柱与以前开发的TSKgel DNA-NPR（2.5μm）色谱柱的分离情况，分析结果见图6。实验结果表明，在优化实验条件下，核酸样品可以在TSKgel DNA-STAT色谱柱上获得更好的分离。

结论

TSKgel STAT系列色谱柱可以在较低的柱压下实现对各种生物样品的高分辨率、高通量的快速分析和痕量制备。