肉及肉制品中新霉素残留检验的高效液相色谱测定方法

(1)试剂和材料 除特殊规定外，所用试剂均为分析纯

①乙腈

②甲醇：紫外光谱纯

③三乙胺

④磷酸(85%)

⑤氯化钠

⑥磷酸盐缓冲液

⑦混合提取液：磷酸盐缓冲液—乙腈(1+)。

⑧硼酸钾缓冲液：将2.5z硼酸溶于80mi水中，用50g/100ml氢氧化钾溶液调pH至lO.5，用水定容至100ml。

⑨邻苯二甲醛试剂：将100mg邻苯二甲醛溶于Iml甲醇中，加入200ul 2—琉基乙醇和10ml硼酸钾缓冲液，用棕色瓶(有盖)贮存于冰箱中，1周内有效。

⑩碱性缓冲液：将76e四硼酸钾溶于400mi水中，用50g/100ml氢氧化钾溶液调pH至11.0，用水定容至500mi。

⑾洗脱剂：碱性缓冲液—甲醇(1十4)。

⑿阳离子交换树脂;D152。

⒀硫酸新霉素标准品：生化试剂

⒁硫酸新霉素标准溶液：称取适量的硫酸新霉素标准品(精确至0，lmg)，用水配成浓度为o.100rug/ml的标准贮备溶液，根据需要再用水配成适当浓度的标准工作溶液。

⒂新霉素衍生物标准溶液：将适量的标准工作溶液注入到阳离子交换柱中，进行衍生化反应，制成新霉素衍生物标准溶液，

(2)仪器和设备

①液相色谱仪：配有荧光检测器

②高速组织捣碎机

③振荡器

④离心机

⑤过滤漏斗;滤孔为80-120um、40—80/um

⑥阳离子交换柱：120mmX 5mm(内径)玻璃柱。用碱性缓冲液将阳离子交换树脂制成悬浮液，平衡2h，装入玻璃柱中，高度约为6cra，用5ml洗脱剂淋洗，流速为0.8ml/min，然后用水洗至流出液呈中性，备用。

(3)测定步骤

①提取 称取试样约l0g(准确至0.1g)于一lOOml锥形瓶中，加人60ral混合提取液和2g氯化钠，振荡30min，经滤孔为80—120~m的过滤漏斗抽滤，残渣用3x10ml混合提取液洗涤。合并滤液和洗液于一250rnl烧杯中。在沸水中加热30min，取下，于3000r/min离心20min，置4℃冰箱中冷却20min，然后经滤孔为40～80bm的过滤漏斗抽滤，收集滤液。

②衍生化 将滤液注入阳离子交换柱中，用lOml水洗柱，弃去流出液。将lml邻苯二甲醛试剂注入柱中，反应5rain。然后加2ml洗脱剂洗脱柱上衍生物。弃去前面iml洗脱液，收集后面lml洗脱液，立即放置在一18~0冰箱中，15min后进行液相色谱测定。

③测定

a.色谱条件

色谱柱：ODSHypersi

柱温：35~C：

流动相：77.5%甲醇水溶液中含0.09mol/L 三乙胺和o.45moI/L磷酸

流速：1.0ml/Illin

激发波长：345nm

发射波长：445nm

进样量：10ul

b.测定 根据样液中新霉素含量情况，选定峰面积相近的新霉素衍生物标准溶液。标准液和样液中新霉素衍生物响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，新霉素衍生物的保留时间约为6min。

④空白试验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。

(4)检测限和回收率

本方法的测定低限为50ug/kg。

在0.05-0.50mg/kg添加浓度水平上的回收率范围为90.4%-96.3%