一种新型细胞划痕实验方法的介绍

一.传统细胞迁移实验技术—划痕实验

1.基本原理

细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上， 用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例如72h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。

2、操作步骤

（1）先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

（2）在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%。

（3）第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只枪头)。

（4）PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。

（5）放入37℃ 5% CO2培养箱，培养。可按0，6，12，24h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定)。

（6）统计方法：使用Image J软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值。
 

3.注意事项：

（1）在用PBS缓冲液冲洗时，贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。

（2）一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖就不能忽略。

（3）按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。

二．传统实验方法主要问题

传统实验方法缺点是细胞增殖对实验结果有影响，即使在无血清或低血清条件时，细胞的状态、代谢等方面会受到影响，由于细胞内信号传导系统整体性的下调，细胞迁移的速度也会慢很多；另外创建“伤口”也可能时大时小，边缘不整齐等误差；还有在镜下拍照观察时，每次观察点基本不可能做到完全一致等。

三．最新实验解决方法-------伤口愈合划痕插件
 

可黏附底部；生物相容硅胶材料；9 mm x 9 mm x 5 mm；两孔（70μl/孔）；每孔生长面积0.22 cm2；可产生500 μm宽的“gap”  

特点：

1. 在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。

2. 非常适合研究细胞与胞外基质（ECM），细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。

3. 与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。

4. 研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。
 
细胞培养插件方法与传统划痕实验比较

细胞培养插件提供重复性更好的实验结果：

左图是伤口愈合插件做出的实验数据统计；右图是枪头划痕做出的实验数据统计

四.方案小结

（1） 新型细胞划痕实验方法可以保证划痕的标准化，保证了实验的重复性－对比枪头划痕，划痕会歪歪扭扭，无法保证每次都一样；

（2）新型细胞划痕实验方法可以避免枪头划痕会伤到包被；手动划痕伤到包被的话，会直接影响了细胞迁移的结果；

（3）直接镜检观察，成像效果良好；

（4）新型细胞划痕实验方法有配套的图像分析，图像分析是通过计算实验区域的空白面积来计算愈合情况的，比分析计算的要更客观准确；

（5）产品用法简介： 只需要在插件的两个孔里种细胞，等细胞贴壁了再拔掉这个插件，细胞之间就会留下一道标准的划痕，就可以开始定时观察细胞愈合的情况了；

（6）多种规格适合不同的实验流程，2孔，3孔，4孔，带培养皿或者插件，细胞追踪实验专用插件培养皿等。