不同强度运动对糖尿病造模大鼠的血清IL-6.β2-MG及肾脏TGF-β1蛋白表达的影响
【摘要】目的
探究不同强度运动干预在糖尿病造模过程对血清白细胞介素6( interleukin6,I-6)、β2微球蛋白(B2 microglobulin,2MG)和肾脏转化生长因子l( transforming growth factor-1,TGF-B1)的影响。方法选取50只SD雄性大鼠,随机分为正常对照组、糖尿病对照组、低强度运动组、中等强度运动组和高强度运动组5组,每组10只正常对照组普通饲料喂养,糖尿病对照组、低强度运动组、中等强度运动组、髙强度运动组髙糖高脂喂养,糖尿病对照组笼中自由活动,低强度运动组、中等强度运动组、高强度运动组实验期间分别进行不同负荷的跑台运动。肾脏组织以过碘酸六胺银( periodic acidsilver methenamine,PASM)染色。酶联免疫吸附测定( enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠血清中I6、全自动生化仪检测血清B2MG的浓度。 Western blot检测大鼠肾脏组织TGFB1蛋白表达。结果PASM染色结果显示正常对照组肾小球结构清晰,基底膜无明显改变;糖尿病对照组、低强度运动组肾小球基底膜有所增厚,系膜区眀显増宽;中等强度运动组、高强度运动组肾小球基底无明显増厚,系膜区轻微增宽。 ELISA结果显示,与正常对照组、糖尿病对照组相比,低强度运动组和中等强度运动组血淸I-6水平均明显下降(P<0.05)。各组大鼠之间血清B2MG水平差异无统计学意义(P>0.05)。 Western blot结果表明各组间TGF-B1的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论在糖尿病造模过程中,8周耐力运动可通过降低机体血清I-6水平并保护肾脏组织结构,且中等强度耐力运动保护作用最为显著。
【关键词】2型糖尿病;耐力运动;肾脏损伤
糖尿病是以血糖升高为主要表现的慢性代谢性疾病之一,主要是由于胰岛素完全缺乏或相对缺乏所致。世界卫生组织估计全球有超过3.46亿人患有糖尿病 在没有任何干预的情况下,到2030年这一数据可能会增加一倍以上。肾损伤、氧化应激、低度炎症是2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)诊断前通常遇到的主要并发症2。白细胞介素6( interleukin6,Il-6)被认为是促炎细胞因子和T2DM的预测因子,是导致胰岛素抵抗和血糖稳态恶化重要因子;并且IL-6浓度对肾小球早期损害较其他指标更敏感L血清中β2-微球蛋白(β2 microglobulin,β2MG)水平可以反映出机体肾小管功能早期损害,是糖尿病肾病早期诊断指标之一。转化生长因子B1( transforming growth factor-B1,TGF-B1)家族中最重要的因子,可促进细胞外基质( extracellular matrix,ECM)的增多,导致肾组织纤维化,促使肾脏疾病的进一步发展。本实验应用高糖高脂膳食联合注射链脲佐菌素( streptozotocin,STZ)建立T2DM大鼠模型,并在模型建立过程中施加不同强度的运动干预,探讨运动干预对T2DM大鼠造模过程中血清IL6、β2-MG及肾脏TGF-B1的影响,研究运动防治糖尿病的机制。
1资料与方法
1.1试剂与仪器
STZ(批号:WXBC6558V,美国 sIgma生物技术公司);大鼠l-6酶联免疫吸附试验( enzyme- linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(批号:13316123115,武汉博士德,中国)、B2-MG检测试剂盒(批号:Y70110,伊利康生物技术有限公司);TGFB1兔抗大鼠一抗(批号:21898,武汉 Proteintech公司,中国)、羊抗兔IgG(批号:LK2001,天津三箭,中国)大鼠跑台ZSPT型(北京众实迪创科技发展有限公司)全自动生化仪(罗氏分析仪 COBAS-O-701)。大鼠饲料(武汉普瑞致医生物科技有限公司),高糖高脂饲料配方:基础饲料64.5%、猪油10%、蛋黄粉5%、胆固醇2%、胆酸钠0.5%、蔗糖18%。
1.2动物分组及造模
实验方案经伦理委员会批准后,向湖北省实验动物研究中心购买6周龄SPF级雄性SD大鼠(许可证
号:SCXK(鄂)2015-0018,No.42000600025097)50只。饲养条件为室温20~22℃、相对湿度40%~70%,光照周期12h,自由进食、饮水。实验在武汉体育学院SPF级实验房进行。适应性喂养1周后,随机分为5组:正常对照组、糖尿病对照组、低强度运动组、中等强度运动组、高强度运动组,每组10只,实验结束时高强度运动组死亡 1只。正常对照组普通饲料喂养,糖尿病对照组高糖高脂饲料喂养,均笼中自由活动;低强度运动组、中等强度运动组、高强度运动组高糖高脂喂养,期间分别进行8周不同负荷的跑台运动参照 Bedford研究,本实验运动方案设计为:低强度运动组跑台速度为8m/min,最大摄氧量(maximal oxygen consumption,VO2max)52.9%,坡度为0°;中等强度运动组跑台速度为15m/min,VO2max 64%,坡度为5°;高强度运动组跑台速度为20m/min,VO2max76%,坡度为10°。每周训练5次,每次1h共8周。于第八周末,隔夜禁食不禁水12h,正常对照组一次性腹腔注射0. 1 mmol/L的柠檬酸缓冲液(30mg/kg),糖尿病对照组、低强度运动组、中等强度运动组、高强度运动组一次性腹腔注射2%的STZ溶液(308/kg注射STZ第八天隔夜禁食,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,摘眼球取血,离心取血清,剖腹取肾脏组织,部分用于组织切片与染色;部分冻存用于 Western blot检测。
1.3肾组织过碘酸六胺银( periodic acid-silverine,PASM)染色根据常用方法制作肝组织石蜡切片,脱蜡水化后进行PASM染色,显微镜下拍照。
1.4血清指标检测检测
采用 ELISA法检测血清IL-6:将已稀释好的亲和素过氧化物酶复合物工作液( avidin-biotin perozdase complex,ABC)和TMB显色液在37℃中平衡30min。配置4000pg/ml、2000pg/ml、1000pg/ml、500 pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml梯度浓度的标准品各100μ1依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液的作为零孔,直接加样品100μl;盖上酶标板恒温(37℃)反应1.5h;将准备好的生物素抗大鼠IL6抗体工作液按每孔1001依次加入(TMB空白显色孔除外)。酶标板加上封板膜,37℃反应1h;缓冲液冲洗3次;ABC工作液按每孔100l依次加入(TMB空白显色孔除外)。酶标板加上封板膜,37℃反应30min;冲洗5次,按每孔90l依次加入TMB显色液,恒温37℃,反应0.5h(避光);按每孔100dl依次加入TMB终止液;用酶标仪在450nm测定各孔吸光度值。采用全自动生化仪检测血清β2MG指标
1.5 Western blot检测肾组织TGFB1表达水平
剪取约50mg组织,加入总蛋白提取液,匀浆,9000r/min,4℃离心10min。蛋白浓度测定采用聚氰基丙烯酸正丁酯(
bicinchoninic acid,BCA)法。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( sodium dodecylsulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis,
SDS-PAGE)上样量40g,电压调至100,溴酚蓝迁至分离胶底部0.5cm处,出胶。免疫蛋白印迹操作转膜,电转完毕后,将电转膜置于5%的脱脂奶粉[吐温-20-三羟甲基氨甲烷缓冲盐溶液(
Tris bufieredsaline with tween20,TBST)配制]中封闭,37℃1h。一抗与靶蛋白的结合,一抗孵育4℃过夜。TBST摇床洗涤,反复稀释)室温下于摇床孵育Ⅰh,TBST摇床洗涤,反复4次,每次5min。将膜浸入配制好的电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)中,室温下孵育1min并轻轻摇动。然后将膜放入荧光化学发光凝胶成像系统,成像得到图片
1.6统计学处理
采用SPSS20.0数据软件包进行统计学分析。切片图像采用定性分析。定量资料以均数±标准差(x士s)表示,多组间的比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用ISDt检验,P<0.05为差异具有统计学意义
2.结果
2.1各组大鼠肾脏PASM染色结果
正常对照组肾小球结构清晰,基底膜无明显改变。糖尿病对照组、低强度运动组肾小球基底膜有所增厚，系膜区明显增宽。中等强度运动组、高强度运动组肾小球基底无明显增厚,系膜区轻微增宽,见图1
采用余丹等8的造模方案,即采用高糖高脂膳食方案已经是一种理想的T2DM动物模型造模方法,并且已有学者发现由STZ诱导形成的大鼠糖尿病肾功能损害与人类相关损伤的形成非常相似10
糖尿病造模组PASM染色观察结果显示,其系膜区明显增宽,同时基底膜厚度有所增加,说明产生一定程度的基质成分积累,推测是肾小球功能代偿性改变而低强度运动组为低强度运动干预,对肾小球组织结构的改变中同样出现了一定程度的肾小球基底膜及系膜区的病理改变,说明低强度运动的干预效果欠佳。但中等强度运动组、高强度运动组的肾脏组织结构未出现明显的病理改变,肾小球的基底膜无明显增厚,系膜区仅轻微增宽,说明运动干预糖尿病的形成过程中,运动强度需要达到中度及以上时,对肾小球的滤过功能改善会有更好的效果。本研究显示中、高运动强度,对糖尿病造模形成过程中肾脏肾小球功能的影响有一定改善。但PASM染色对肾小球基底膜的染色显示尚缺乏精确性,肾小球基底膜的超微结构显示才能更好的说明其结构与功能的状态,将在今后的课题中进步深入研究。本研究采用的运动方案参考
Bedford等(研究方案,分别为52.9%VO2max、64%VO2max、76%VO2max时间长度为1h,三种运动方案属于长时间的耐力运动,且本次实验的研究结果中等强度运动组和低强度运动组的血清Il-6含量显著低于糖尿病造模组和对照组(P<0.05)。
Hopps等研究发现抗炎作用与运动方式和强度以及持续时间有关,与本研究结果相同。马涛等2研究发现,通过对高脂膳食大鼠进行游泳运动干预可以降低血清TNFα和IL-6水平。唐晖等研究发现长期的耐力训练会降低骨骼肌IL-6mRNA的表达。大量研究发现单次运动后IL-6浓度明显升高,并且收缩肌肉中释放的ⅠL-6造成运动后血Il-6水平的增加13。缺乏运动可导致内脏脂肪累积,促进炎症细胞渗透入脂肪组织,增加脂肪因子沉积并导致代谢性炎症,但是长期低强度运动可增加抗炎因子并预防多种慢性疾病的发生。本次实验中等强度运动组和低强度运动组血清Ⅰ-6水平显著降低,体现岀长期的中低强度的耐力训练可降低造模过程中炎症因子水平,提升机体的抗炎能力,预防慢性炎症对内脏器官的进一步损害。但本研究结果显示高强度运动组血清IL-6含量没有显著下降,可能与高强度运动组运动量过大有关,具体机制还有待进一步研究。本实验中各组间血清β2MG水平没有显著性差异,可能是因为糖尿病发展缓慢,在糖尿病造模过程中肾脏损伤程度不足以引起血清β2MG水平发生变化。糖尿病的肾脏纤维化是糖尿病过程中最严重的微血管病变,也是肾衰竭的主要原因。TGF-β1则是糖尿病肾纤维化经典信号通路的重要位点,导致多种肾损伤出现进行性肾衰竭,被公认为是最主要的纤维化因子。Boor等对8周龄大鼠进行中等强度运动干预,发现运动组促纤维化细胞因子TGFB1mRNA表达量降低。毛彦稳等研究发现SD大鼠糖尿病造模6周后,糖尿病组TGF-β1表达含量显著高于正常对照组。蒋文娟等8研究发现糖尿病大鼠肾组织中TGFB1表达的增加程度与肾脏损害的严重程度致,而在本实验中发现各组间肾脏损伤因子B2MG变化趋势和各组间肾脏TGFB1表达趋势一致。但是各个运动组与糖尿病造模组和对照组间并无显著性差异,其内在机制并不清楚,可能与运动干预阶段仅在T2DM动物造模形成过程中有关,相关影响因子对肾脏的影响时间及影响程度不足以引起肾脏TGF-B1表达发生改变总之,在T2DM大鼠造模过程中,施加8周的耐力运动干预,肾小球基底膜出现一定的改善,对大鼠肾脏组织结构具有一定保护作用,其作用机制可能是通过降低大鼠血清炎症因子I1-6水平。同时,肾脏损伤因子血清β2MG水平与肾脏纤维化表达因子TGFB1表达并未发生明显变化,可能与相关影响因子对肾脏的影响时间及影响程度不足有关,但具体作用机制还需进一步研究。
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