细胞如何检测是否支原体污染？

我的细胞，居然背着我养“小三”！

那“小三”，名叫  支 · 原 · 体 !!!

因为这“小三”，我的细胞表现都变了！
瞒我这么久，原来这些日子都是假的！

就让BI带您来了解这位不速之客吧！

全球实验室状况支原体流行中

▲ 全球平均有约15~35%细胞实验室发生支原体污染（65~80%严重污染），超过一半实验室有两种支原体污染；而全球各地的细胞库中，也有发现5~35%不等的支原体感染率，日本甚至高达60%。

但！全球目前有在做常规支原体监控的细胞实验室却不到50%！ 

支原体知己知彼

支原体为细菌的一类，最早在1898年由法国 E. Nocard 及 E.R.Roux 从肺疫牛隻中分离出来，1956年才正式命名为支原体 (Mycoplasma)；支原体大小介于细菌与病毒之间 (直径介于0.15-0.3µm)，为目前发现最小最简单的原核微生物，唯一可见的胞器是核糖体，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜 (下图1)，所以呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态 (下图2)。

▲ 图1：支原体结构图

▲图2：支原体的各种形态

大多支原体基因组只有0.58－1.38百万碱基，这使得它的生物合成能力薄弱，必须利用本身细胞膜表面高密度的黏附素附着于宿主细胞表面，并交换宿主的细胞质及细胞膜成分，来获取增殖需要的物质。但由于支原体生长条件复杂，使得菌体培养困难重重，导致过去支原体一直不受关注；近几年，拜分子生物学与基因组学的进步所赐，基因构造简单的支原体已引起了较为广大注意。

敌人清单实验室污染种类

至今，共有超过180种支原体被发现，有超过20种能感染体外培养的细胞，而目前实验室最常见(95% 以上)的支原体则来自其中6种：

• 源自于实验人员鼻腔、口腔，并经由飞沫传至培养细胞中的口腔支原体（M.orale）、猪鼻支原体（M.fermentans）及人型支原体（M.hominis），居于首位（占总体的50%以上）。

• 其次则为大多来自牛血清的精氨酸支原体（M. Arginini）、莱氏无胆甾支原体（A. Laidlawii）、及来自猪源胰酶的猪鼻支原体（M. Hyorhinis）。
  

• PS：BI胰酶经过辐照，不含活的支原体。

• 可恶的东西支原体“麻烦精”

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  既然支原体是细菌的一种，抗生素一加不就好了吗?  
  为什么可以搞到全球这么多细胞库污染?

  你说，支原体烦不烦！
  怎知有“小三”？检测检测再检测

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  目前检测方法可大致分成四种：
  ■微生物培养法
  将样品培养在特殊琼脂培养基上，在37ºC有氧环境中孵育2周，阳性培养基上会长出100~400um大小的“煎蛋状”菌落。
  ■DNA萤光染色法
  支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），容易被Hoechst 33258此荧光剂染上，被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点。
  ■ELISA法
  将支原体16S核糖体RNA标上标签，然后用特定抗体预包被过的微孔板对标签进行捕获，再加入显色用的抗体及底物，最后通过比色法得出检测结果。
  ■PCR法
  原理为扩增支原体16S核糖体RNA的基因，能检测多达19种支原体，操作快速、准确性高，市面上有多款相关产品可参考 (BI：EZ-PCR支原体检测试剂盒)。
   

  看我妙招
  怎么消灭“小三”

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  消灭支原体依不同处理发法，分成四大类：
  ■物理法：高温高压灭菌
  ■免疫法：使用支原体特异性抗血清、裸鼠传代法
  ■化学法：界面活性剂处理（BI：Pharmacidal 支原体喷壶）
  ■生化法：使用抗生素等药物（BI：BIOMYC 支原体处理试剂）

  　目前，大环内酯（Macrolides）、四环素（Tetracyclines）和喹诺酮（Quinolones）这三类抗生素，是公认对抗支原体效果最佳的药物，而市面上有许多针对不同菌株配置的抗生素产品可以参考。

  如果你的细胞检测结果为～

  　　＂无支原体污染＂

  那恭喜你啦！要好好维持！
   

  要怎么预防支原体污染?

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  培养良好的无菌操作实验习惯
  感冒咳嗽时尽量不要使用细胞房，如果必须使用，请在实验后彻底清洁消毒使用空间。

  新购产品检测
  新购买血清等动物源产品、细胞株等，在使用前先做支原体检测；或从有资质的正规厂商购买相关产品。（上海逍鹏生物-以色列BI细胞培养试剂）

  常规工作要落实
  定期检测使用中的细胞，定期擦拭、清洁实验室环境（BI：Pharmacidal 支原体喷壶）。

  最小化抗生素使用频率
  非珍贵细胞污染，请直接丢弃，避免抗生素滥用导致抗药性产生

• 支原体体积非常小, 极易通过0.22um滤膜, 且一般光学显微镜无法观察到。                                      

• 支原体能附着并存活在器物表面(操作台, 培养箱,显微镜等), 提高操作污染概率。                              

• 支原体生长缓慢，通常不破坏宿主细胞但默默改变了细胞生长代谢，且对传统抗生素具抗性，因为抗生素大多破坏细菌细胞壁, 而支原体恰恰没有细胞壁。                                   

• 支原体污染初期, 培养基不变色, 细胞形态正常，但等大量污染时, 为时已晚, 耗时又耗力。

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参考资料
Sugandha,G. Mycoplasma: Morphology, Cell Shape and Reproduction.

Nikfarjam Laleh, Farzaneh Parvaneh. Preventionand Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Culture. Cell J. 2012.