重组人蛋白细胞因子的研究选择—细胞因子

1．重组蛋白表达体系

MCE 重组蛋白表达体系主要有：大肠杆菌，酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞。

2．重组蛋白纯度和浓度测定

重组蛋白纯度测定方法：a. SDS-PAGE 测定法；b. HPLC 测定法；c. 银染测定法。

重组蛋白浓度测定方法：a. Bradford 蛋白定量测定法；b. BCA 蛋白定量测定法；c. SDS-PAGE 蛋白定量测定法。

3．重组蛋白表达体系对比     

4．重组蛋白表达体系选择

5．重组蛋白开盖使用前处理

为防止冻干粉产品的粉末沾在管壁或管盖上，使用前请勿开盖，离心(约13000 rpm)处理 20-30 秒，使附于管盖或管壁的蛋白收集于管底。MCE 保证每管产品的蛋白总量达到标示含量。

6．重组蛋白复溶

a. 使用前先离心(约 13000 rpm)处理 20-30 秒，使附于管盖或管壁的蛋白收集于管底。

b. 严格依据说明书，使用推荐的溶液将蛋白冻干粉溶解至推荐的浓度。大多数重组蛋白建议溶解在灭菌超纯水中，浓度不低于 100 μg/mL，以便于后续进一步稀释至工作浓度。

c. 用移液枪轻吹混匀，或将管盖盖好后轻柔颠倒数次进行混匀，低速离心数秒。

d. 复溶后的重组蛋白在室温放置数分钟，以保证蛋白能够充分溶解。

7.重组蛋白储存

由于每次冻融都会造成蛋白的部分变性，因此建议客户收到产品后适量分装避免反复冻融。

a. 短期储存：

冻干粉状态产品在室温下存放 3 周，不影响活性。复溶后的产品在 4℃ 可稳定储存 1-2 周。

b. 长期储存：

冻干粉状态产品在 -20℃ 下，可稳定保存至少一年；推荐 -80℃ 长期保存，以获得更稳定性能的产品。可选择包含一定浓度载体蛋白(0.1% BSA， 5% HSA， 10% FBS，或 5% 海藻糖)的溶液或培养基复溶产品，分装后冻存于 -20℃ 下，可保存至少三个月；推荐 -80℃ 长期保存，以获得更稳定性能的产品。

注：分装冻存时，蛋白浓度不低于 100 ng/μL，且每管的体积不可小于 20μL。

8.重组蛋白标签影响

蛋白标签指重组蛋白制备过程中与目的蛋白融合表达的蛋白或多肽。MCE的重组蛋白产品大部分为无标签状态，但少数重组蛋白产品因为不同目的需要加有标签。

a. 标签利于蛋白纯化。

b. 当目的蛋白无特定抗体直接鉴定，可利用标签进行 Western Blot 或ELISA 分析方法鉴定。

c. Fc 标签可以提升重组蛋白的半衰期以提高分子的稳定性，同时也能够促进重组蛋白形成活性二聚体。

重组蛋白标签对蛋白的生物学活性影响存在未知结论，但对大部分检测应用中，重组蛋白的标签对蛋白本身生物学活性并无影响，所以无需移除。MCE 对重组蛋白产品都已经做过生物学活性检测并将数据公示于 COA 中。

9. 重组蛋白活力值与计算方法

MCE 重组蛋白的生物学活性 (ED50) 测定数据在 COA 中可以获得。ED50 是Effective Dose 50 的缩写，是可诱导 50% 最大反应的蛋白浓度 (ng/mL)。

计算公式如下:

MCE 的重组蛋白产品并未采用 WHO (National Institute for BiologicalStandards and Control) 设定的标准来测定活力值，以上计算公式并不适用于“International Units”和“ED50”的转换关系，需要采用国际标准品对比相同实验获得该重组蛋白的 IU 值。

10. 重组蛋白 ED50 值的批间差

不同批次的产品或不同实验方法的测定都会导致重组蛋白产品的 ED50 值变化，我们推荐客户根据自己的实验测定得到最合适的实际 ED50 值。

11. 重组蛋白应用方案

MCE 重组蛋白产品的 COA 中显示的实验方案只是确认该产品的 ED50 值，但并不与终端客户的不同类型实验结果存在等效性。如果客户需要应用在不同于本公司产品测试的实验方法时，我们建议客户通过实际测试获得最佳 ED50 值。

12.重组蛋白的种属交叉活性

重组蛋白的种属交叉活性需要根据具体产品而定；建议尽量选择对应种属的重组蛋白。如实在无法匹配种属，以下信息供参考：

a. 大多数人细胞因子对小鼠细胞有效 (仅少数例外)。

b. 多数小鼠细胞因子对人细胞有效，但特异性可能不强。如小鼠的表皮生长因子(EGF)对人的表皮细胞有活性，对人的其他种类细胞可能也有作用。

c. 干扰素、GM-CSF、IL-3、IL-4 具有种属特异性，即重组人的这些细胞因子只能作用于人细胞，对小鼠和大鼠等其他种而重组小鼠的这些细胞因子也仅用于小鼠，对人的细胞无效。

d. 成纤维细胞生长因子 (FGFs)、神经营养素 ( Neurotrophins，如 BDNGF、GDNF、CNTF、β-NGF 等)、TGF-β 等高度保守，各种属间交叉活性强。