ELISA方法学：开发实践中不可不知的亲和力测定方法开发2

亲和力数值越小则亲和力越强，亲和力的强弱决定了最终决定反应完成时可逆反应各组分相对多少。

如例子B和C同样是和200nM CD279（PD1）反应，抗体pembrolizumab (PD1抗体)相对于CD279的亲和力为0.4nM, 配体CD274（PDL1）相对于CD279的亲和力为8200 nM,最终反应生成的pembrolizumab-CD279复合物是97.86 nM,而CD274- CD279复合物仅仅只有2.35nM，两者相差42倍。

有别于不可逆反应，除了抗原抗体的摩尔浓度外，抗原和抗体（配体和受体）两者间的亲和力将极大的影响可逆反应中生成物的多少。

三、你知道ELISA进行方法学开发时的基本原则吗？

对于亲和力测定方法和原理的概述，读者可参考生物功能学筛选评价技术之亲和力评价篇。

本文主要对饱和浓度法进行概括。

R代表受体或抗原，L代表配体或抗体。

采用饱和浓度法，如果要测定配体相对于受体的亲和力，少量R存在的情况下，将L进行梯度稀释，检测R-L复合物的浓度，当R-L复合物的浓度占总R浓度的一半时，L对应的浓度值（EC50）即L相对于R的KD值。

RL复合物/R即B值可用检测的信号值代替，梯度稀释的L和信号之间的函数关系满足下面的公式，只有在此在特定的实验条件下EC50值能够等价于KD值。

饱和浓度法测定KD值有几个关键点，即相互作用的两个分子，R要少量，L要进行连续的梯度稀释，需要得到最大的信号响应值（所有的R的结合位点被L占据）即平台期，那么在此条件下，占据一半R时，所需要的L浓度（EC50）为KD值。

饱和浓度法主要测定的是代表RL复合物的信号值，测定方法可以是流式细胞术、同位素标记术、荧光偏振，也可以是ELISA。

四、用于亲和力测定的ELISA方法学开发常用方法

布局

一般操作流程

01 酶标板的制备：取浓度为100 ug/ml抗原，室温溶解，混匀用包被液按如下步骤稀释至0.2ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，按加样布局表加入100ul/孔，分别加入酶标板条中(Note 1)，其中加入包被液做包被抗体的空白对照，2-8℃过夜；

02用洗涤液洗板3次，拍干，加入300ul/孔封闭液(Note 2)室温封闭1小时；洗涤液洗板3次，拍干待用；

03 按照布局将抗体以100000ng/ml起始3倍梯度稀释（Note 3），按照布局，100ul/孔加入微孔板中；

04放入微孔板振荡器 (ISLDMPHDG)内，设置37℃、600rpm振荡1小时；   

 

05用洗涤液洗板3次，拍干；

06酶联抗体稀释到合适的浓度（Note 4），在奥豪斯涡旋仪（VXMNFS）上混匀，100ul/孔；

 

07放入微孔板振荡器内，设置37℃、600rpm振荡1小时；