circRNA机制研究汇总（二）

结合蛋白：
（2）CircNfix与Ybx1结合并促进其降解：circNfix和对照组的蛋白质谱分析（A）。采用Ybx1、Nedd4l或阴性IgG抗体进行RIP实验（云序生物提供该服务）（B）。P0 CMs中过表达circNfix后Ybx1蛋白表达水平（C-D）。qRT-PCR检测P0 CMs中Ybx1 mRNA表达水平（E）。RNA FISH在P0 CMs中过表达和不表达circNfix时， circNfix和Ybx1的亚细胞共定位（F）。分馏实验表明，circNfix过表达促进了Ybx1在细胞质中的易位，增加了Ybx1在细胞质中的降解（G）。在circNfix和Ybx1干扰后，细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白B1的表达水平（H）。ChIP-qPCR（云序生物提供该服务）检测显示，cyclin A2和cyclin B1启动子中Ybx1结合位点扩增（I）。细胞裂解物用抗Ybx1抗体免疫沉淀，用泛素(Ub)特异性抗体、抗Ybx1抗体或抗nedd4l抗体免疫印迹分析进行WB分析。过表达circNfix的CMs中Ybx1蛋白表达水平（K-L）。

ceRNA机制：
（3）circNfix与miR-214的相互作用：预测miR-214和miR-761能够与circNfix结合（A）。成年小鼠心脏中下调circNfix后，miR-214和miR-761的表达（B）。双荧光报告实验检测miR-214和circNfix能够直接结合（C）。RNA pull-down（云序生物提供该服务）实验检测circNfix能够拉下miR-214（D）。RNA FISH实验检测P0 CMs中，miR-124和circNfix能够共定位在胞质中（E）。RNA FISH实验检测P0 CMs中，miR-124和Gsk3β能够共定位在胞质中（F）。双荧光报告实验检测miR-214和Gsk3β 3’UTR直接结合（G）。WB检测干扰circNfix后Gsk3β蛋白的表达水平（H）。WB检测干扰或过表达miR-124后Gsk3β蛋白的表达水平（I）。WB检测干扰circNfix和miR-214后Gsk3β蛋白的表达水平（J）。CMs中，干扰circNfix后β-catenin的表达水平（K）。CMs中，干扰Meis1后Meis1和 Gsk3β的表达水平（L）。CMs中，干扰Meis1和circNfix后GSK3β的表达水平（M）。干扰circNfix, Ybx1, miR-214 和 Gsk3β后，P7 CMs进行pH3 和 Aurora B免疫染色（N）。

总结

circNfix如何通过与Ybx1和miR-214结合来调控心脏再生过程：转录因子Meis1与circNfix的SE结合后，抑剂circNfix的表达，缺失的circNfix能够增强Ybx1与Nedd4l (E3泛素连接酶)的相互作用，并诱导Ybx1发生泛素化降解，并进一步抑制下游cyclin-A2和cyclin-B1的表达。同时，缺失的circNfix能够，降低对miR-214的吸附，进一步抑制Gsk3β及VEGF的表达，最终促进心肌梗死后心脏再生修复和功能恢复。