活体成像——让肿瘤细胞无处遁形

在科普今天的知识前，不禁让小编回忆起大学校园的美好时光，那个时候小编还是个走在绿树荫下的青涩少年啊，在一次参加关于肿瘤免疫学的学术会议上，看到了类似下面这种图，我就在想，这小鼠是修炼了什么内家功法，被打通任督二脉了？那五颜六色的东东是什么？经过向老师还有身边的小伙伴们请教才知道，这是利用活体成像技术做到的哇！当时觉着这东西好高大上啊，小编真是孤落寡闻了，实在惭愧！小编后来对这个技术进行了一番考究，下面就给大家说道说道。

图1.活体成像^[1]

早在1999年由美国哈佛大学Weissleder博士（图2）率先提出了分子影像学(molecular imaging，MI)的概念，即应用影像学的方法对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。活体成像便是基于分子影像学孕育而生的，通过这个成像系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移，感染性疾病的发展进程，特定基因的表达等生物学过程。

近年来，我国医疗健康产业发展突飞猛进，新药研发逐渐成为科研机构和医药公司重点研究领域，其中活体成像为药物研发贡献了一份十分宝贵的力量。目前，小动物活体成像技术应用到药物研发的实验方法主要有生物发光和荧光两种。

基于生物发光的活体成像技术方法与应用

生物发光主要是应用荧光素酶（Luciferase）对基因、细胞和活体动物进行标记。标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术，将荧光素酶的基因插入到预期观察的细胞染色体内，通过对克隆细胞进行筛选，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。再将细胞株转移至特定的小鼠体内形成模型。向模式小鼠注射一次荧光素（荧光素酶的底物）能保持其体内荧光素酶标记的细胞发光持续30-45分钟。因为每次荧光素酶催化反应只能产生一个光子，这是肉眼无法观察到的，因此需要先进的成像系统，再应用一个高度灵敏的制冷CCD相机以及特别设计的成像暗箱和成像软件，才可

简单来说，荧光素酶与底物反应后，会产生化学发光。这种光是由化学反应而来，不需要激发光。仪器记录的是单位时间内检测到的光子数，也就相当于直接定量的记录了表达荧光素酶的细胞数量。

图3. 应用制冷CCD相机捕捉光源

下面随小编一起来看一组活体成像技术在多发性骨髓瘤血液系统疾病上的应用示例：Myc 基因是细胞增殖的主要调节因子，而且对于癌症肿瘤细胞分裂，新陈代谢和存活都有重要作用。JQ1是用来抑制BET溴区结构域的小分子，而且可以下调Myc基因转录水平。将JQ1腹腔注射到荷多发性骨髓瘤（经Luciferase标记）小鼠中，活体成像系统显示JQ1可以抑制骨髓肿瘤细胞生长且提高肿瘤小鼠的存活率（图3A-B）。结果说明应用JQ1 能够缓解骨髓瘤癌症症状(肿瘤发展与荧光强度线性相关)。^[5] 

图4.小鼠静脉注射Luciferase标记多发性骨髓瘤的活体成像图^[5]

基于荧光的活体成像技术方法与应用

与生物发光不同，荧光技术是采用荧光报告基因 (GFP、RFP等) 或荧光染料（包括荧光量子点等新型纳米标记材料）进行标记，利用报告基因、荧光蛋白质或染料产生的荧光，就可以形成体内的生物光源。生物发光是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而荧光则需要外界激发光源的激发，才可以被成像系统检测到。荧光标记很广泛，可以是动物、细胞、微生物，也可以是抗体、药物、纳米材料等^[1,3,4]。

接下来小编带大家再看一组应用荧光技术的实验：为研究模式蛋白的肿瘤靶向性，将一种近红外荧光分子吲哚菁绿（ICG）包载PDPA（人血清白蛋白表面定点原位生长出具有pH响应性的高分子链）制成纳米荧光探针（HDI），ICG包载在胶束核内而发生荧光聚集淬灭，但到达肿瘤时，由于肿瘤微环境的弱酸性，胶束解体，ICG释放出来而恢复荧光，同时由于PDPA质子化带正电，有利于其吸附在细胞表面以及细胞内吞，从而实现肿瘤靶向荧光成像。本项研究也表明，在蛋白表面引入pH响应性高分子链可提高蛋白靶向性，药用蛋白可采用此项技术提高药效且降低副作用，同时该响应性蛋白质-高分子偶联物自组装体系也可作为小分子药物载体，从而拓展了蛋白药物和小分子药物的临床应用^[6]。（图5）

图5. 小鼠静脉注射HDI纳米荧光探针后C8161黑色素瘤在体内和体外荧光成像图^[6]

虽然荧光信号远远强于生物发光，但非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光。两者具体优缺点详见表（一），对于不同的研究，可根据二者的特点以及实验需求，选择合适的方法哦^[7]。 

表（一）

 

当然，除了上述两个方法外，也有通过Luciferase标记肿瘤，再用荧光探针标记抗体进行研究的。如图6所示，应用BLT（生物发光成像）对稳定表达Luciferase的小鼠乳腺肿瘤4T1进行定位（图6A），再对小鼠尾静脉注射荧光探针（IRDye800CW）标记的PD-1抗体，经FMI（荧光成像）检测PD-1-IRDye800CW生物分布（图6B）。^[8] 通过这种方式，我们可以一边观察肿瘤细胞在哪里，一方面观察抗体药分布情况，看上去就更高端了，有没有？

图6. FMI检测荷4T1-Luc乳腺肿瘤小鼠的PD-1-IRDye800CW生物分布^[8]

重点来啦，百奥赛图目前拥有自主开发的B-IL17-EGFP敲入小鼠，该小鼠模型所有表达IL17的组织细胞同时表达绿色荧光蛋白(EGFP)，用以研究与细胞因子IL-17相关的一系列慢性疾病^[9]。药理药效平台拥有多种GFP-Luciferase细胞系及肿瘤模型，可以进行皮下及原位肿瘤模型建立或转移瘤模型建立，开展针对相应模型的体内药理药效服务^[10]。基因编辑平台可根据客户需求提供多种报告基因（如EGFP、mRFP、mCherry、mYFP或LacZ等）小鼠(目的基因的位置引入报告基因)，方便研究目的基因启动子的转录活性，监控目的蛋白表达定位及细胞运转等^[11]。如有需要，欢迎小伙伴们详细咨询哦！

 

参考文献

[1] Stout D, David J. Optical Bioluminescence Protocol for Imaging Mice. Methods Mol Biol. 2018;1790:29-40.

[2] https://en.wikipedia.org/wiki/Ralph_Weissleder

[3]王红建，熊晓鹏，戴云海等。活体生物发光成像技术及其在消化道研究领域中的应用. 胃肠病学和肝病学杂志。2010

[4]李冬梅，万春丽，李继承。小动物活体成像技术研究进展.中国生物医学工程学报。2009

[5] Delmore JE,et al. BET bromodomain inhibition as a therapeutic strategy to target c-Myc. Cell. 2011 Sep 16;146(6):904-17.

[6]LiP, SunM, XuZ, LiuX, ZhaoW, GaoW.Site-Selective in Situ Growth-Induced Self-Assembly of Protein-Polymer Conjugates into pH-Responsive Micelles for TumorMicroenvironment Triggered Fluorescence Imaging. Biomacromolecules. 2018 Nov 12;19(11):4472-4479.

[7]https://baike.baidu.com/item/可见光活体成像技术

[8]Yang Du,et al. Improved resection and prolonged overall survival with PD-1-IRDye800CW fluorescence probe-guided surgery and PD-1 adjuvant immunotherapy in 4T1 mouse model.Int J Nanomedicine. 2017; 12: 8337–8351.

[9]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/103.html

[10]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/13.html

[11]http://www.bbctg.com.cn/index/index/geneinfo/id/46/cateid/65/cid/12.html