Southernblot检测技术在模式动物制备中的应用‍（二）

图4. Southern blot鉴定同源重组事件^[4]

另外，在制备基因敲进和条件性基因敲除模式小鼠过程中，Southern blot检测是非常重要的一步。在我们以往的工作中，其中一例Cre定点敲进课题（如图5），Southern blot检测结果显示：小鼠1号，有明显的随机插入现象。

图5. Southern blot 检测定点敲进

Southern blot检测技术虽不是万能的，但绝对是金标准！

也有人会说：既然是随机插入，很可能插入在不同染色体，理论上就完全可以通过后续交配稀释或去除，那再多交配一代是不是就可以稀释甚至去除随机插入呢？

让我们看看事实是怎样的：依据我们大量的数据统计分析发现，采用ES细胞方式制备，大约有20%的概率有随机插入，由于ES细胞法制备中可以在细胞这一步就进行Southern鉴定，进入下一批小鼠制备的ES细胞可以确保为Southern阳性；而采用CRISPR/Cas9技术，随机插入的概率约32%，不同的是用CRISPR/Cas9就直接得到了小鼠，只能在小鼠水平筛除随机插入。而这32%中有14%的随机插入是无法靠交配传代去除的（见图6）。是否“随机插入”不是真的“随机”的呢？是不是像转基因一样，更多的情况是打靶载体或插入序列，会容易在目的插入位点插入多个拷贝，造成同一染色体/同一位点的多拷贝“随机”插入呢？^[8] 我们没有详细做过调研，但是接近一半可分离的随机插入比例，预示了有这种可能。而此时，只能通过Southern blot对基因组DNA特定序列定位，进而排除随机插入的风险。^[5-6]

因此，Southern blot虽然有它自己的限制，如费用高，片段有技术极限等，但仍然是模式动物制备检测随机插入的金标准！

图6. 随机插入的概率分析^[5]

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

[2] Nelson, D.L, Cox, M.M.Lehningers Principles of Biochemistry, 5th edition. 2008

[3] Sommer D, et al.Efficient genome engineering by targeted homologous recombination in mouse embryos using transcription activator-like effector nucleases. Nat Commun.2014;5:3045.

[4] http://ko.cwru.edu/info/targvect design.html

[5] http://www.sohu.com/a/24558079 3_227596

[6] http://www.bbctg.com.cn/index/index/knowledge/id/52.html

[7] https://baike.baidu.com/item/southern blot

[8] Ng P, et al. The Molecular Basis of Multiple Vector Insertion by Gene Targeting in Mammalian Cells. Genetics.1999 Mar;151(3):1143-55.