生物亲和素ELISA知识

生物素亲和素 (又称抗生物素) 系统 (biotinavidinsystem,BAS) 标记抗体的技术是 20 世纪 70 年代后期发展起来的一种新的免疫检测方法。由于亲和素与生物素间的亲和力极强，结合迅速，且极其稳定，生物素标记抗体和酶的标记率高，又不影响蛋白的活性，使 BAS 标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。

目前生物素和亲和素 (近年来，在 BAS 检测中多用链霉亲和素「streptavidin,SA」，它是链霉菌培养过程中的分泌物，完整的链霉亲和素和从卵白中提取的亲和素一样，也由 4 条相同的肽链组成。因链霉亲和素在检测应用中发生的非特异性结合远较亲和素低，因此日渐受重视，已有取代亲和素之势。各种抗体或酶的标记物在国内已有商品供应，使用方便。

BAS ELISA 具有的特点：

①对于所有的抗原抗体系统，包括免疫细胞化学、ELISA、免疫印迹法等都适用，应用范围极广；

②BAS 在温和条件下可与各类生物大分子如蛋白质、脂多糖等结合，并且这种结合对原生物大分子的生物活性无影响；

③每个亲和素分子可与 4 个生物素分子结合，所以可以偶合更多连接生物素的酶分子，从而大大提高了灵敏度；

④生物素和亲和素间亲和力强，故二者一旦结合，就极为稳定，不受在 ELISA 方法中的保温及多次洗涤影响，而且这种结合反应时间比抗原抗体反应所需时间短；

⑤结果专一性强，非特异性显色或染色背景极低；

⑥第一抗体稀释度高，可节约抗体。

原理：

生物素或亲和素与抗体分子或标记物结合后，既不影响前者的亲和力，也不改变后者的特性。亲和素分子的 4 个活性部位并非都和连接在抗体分子上的生物素残基结合，剩下的游离部位尚可作为另一种生物素标记蛋白质的受体。这些特点就是 BAS 免疫标记技术的基础和原理。

BAS 基本检测方法可分为两大类：一类以游离亲和素居中，分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为 BAB 法或桥联亲和素生物素法 (bridged avidinbiotintechnique,BRAB)，其改良法称为 (avidinbiotincomplex,ABC) 法。另一类以标记亲和素连接生物素化大分子反应体系，称为 BA 法或标记亲和素和生物素法 (LAB)。

现分别介绍如下：

1. BA 法亦称 LBA 法。系将特异性抗体生物素化，将酶分子标记在亲和素分子上，生物素化抗体与被检抗原结合后，再借 BAS 的高度亲和力将酶分子联结到抗原分子上，经酶促反应即可检出抗原。
   

2.BAB 法亦称 BRAB 法。系将特异性抗体生物素化，将酶分子标在生物素上，然后以游离亲和素桥联物，使被检抗原、生物素化抗体和酶标生物素联成一体。

3.ABC 法原理与 BAB 法基本相同，只是亲和素和酶标生物素需要先按一定比例形成 ABC 复合物，这种网络结构结合了大量的酶分子，当亲和素尚未被酶标生物素饱和时，生物素化抗体即可与之结合。BASELISA 的三种基本检测法。

上述方法中，如将第二抗体生物素化，即为间接法。由于间接法增加了一级抗原抗体反应，因而比直接法更敏感，应用范围更广。近年来许多学者对上述基本方法进行了改良，有人用亲和素抗体或 A 蛋白作桥联物。另外还发展了 BAELISA 竞争法和抑制法等。