微流控芯片技术的肺癌循环肿瘤细胞检测及单细胞分析

我国是肺癌高发国家,近十年肺癌的发病率分别占男性和女性恶性肿瘤的第一和第二位,并且发病年龄有下降的趋势。肺癌的死亡率在恶性肿瘤中始终居于首位，根本原因是肺癌的高转移能力。因为肺癌具有极强的侵袭性及转移能力，大多数患者就诊时已处于晚期（III期、IV期），失去最佳的治疗机会。因此，提高肺癌检出率、控制转移是临床亟待解决的难题。

    现有的肺癌诊断手段主要包括影像学、血清肿瘤标志物、组织病理学和细胞学检查。影像学检查能够直观地评价肺癌的大小和进展情况，但灵敏度有限，很难检测到微小病灶。血清肿瘤标志物检测可用于辅助诊断、监测肿瘤进展和复发，但是目前尚缺少特异的肺癌血清肿瘤标志物，易出现假阳性和假阴性。病理学和细胞学诊断是肺癌诊断的“金标准”，但是要通过手术或者穿刺的方法获得活检样本，对患者创伤较大，而且取材受限，不能实时监测肺癌的动态发展。

循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）检测作为一种液体活检技术，试图克服现有肺癌诊断手段的不足，提高肺癌检出率。研究表明CTC检测有助于预测肿瘤转移、评估预后，而且可以反映肿瘤特征，作为靶向治疗的靶标指导治疗。同时，外周血CTC检测具有创伤小、顺应性好、操作方便及可重复操作等优势。因此，作为一种“液体活检”技术，CTC检测有助于提高肺瘤的检出率，为患者争取最佳治疗时间，制定最适的治疗方案，从而改善患者预后。然而，由于CTC数量微少，平均109个血细胞中约有1-100个CTC。因此，构建高效、高特异性的检测方法对CTC的临床应用至关重要。

现有的CTC检测和富集分选技术依据分离原理的不同，主要分为两大类，一类是基于物理学特性的分选，另一类是基于生物学特性。前者主要是依据肿瘤细胞与血细胞的尺寸不同、密度不同、所带电荷不同等方法将CTC从外周血中分选。优点是操作简单、快捷、高通量且成本相对较低等，但缺点是分选效率不高、纯度较差。后者主要是依据免疫学反应，根据CTC表面所表达的特异性蛋白，通过免疫亲和反应将其分离，其中最常见的特异性蛋白是上皮粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）及细胞角蛋白（Cytokeratin, CK）。其中，被FDA认证的Cellsearch System就是根据正分选原理，通过纳米磁颗粒富集上皮来源的CTC，推荐应用于转移性乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌的CTC检测。但是，由于CTC具有较强的异质性，使该方法在一些患者中的CTC检测效果并不理想 。因此，如何克服CTC检测手段的局限性，构建高效的CTC检测技术倍受关注。

    随着微流控技术对细胞生物学影响的不断加深,以及其在集成样品预处理和血液成分分析中的优势，使其可以更温和、快速、一致地操控和分选活细胞，有利于更准确高效地提取血液等体液样品中的信息，非常适用于血细胞、癌细胞等体细胞的检测。近年来，国内外学者在肿瘤细胞的微流控分选领域中取得了一系列的成就，微流控芯片技术正逐步成为细胞分选的主要工具，应用微流控芯片技术可精确操控样品中的细胞，有望实现高效率、高纯度的CTC检测。同时，微流控芯片的制作成本较低、体积较小，易于制备便携式仪器，更易临床普及应用。基于微流控芯片的CTC检测方法主要分为两类，一类是基于物理学特性的检测，另一类是基于生物学特性。前者最常见的是应用过滤芯片或确定性侧向位移（deterministic lateral displacement, DLD）芯片，根据细胞尺寸大小的不同，将CTC与血细胞分离。Zheng等设计的滤过膜芯片在0.1-0.2mL/min的通量下可实现80%的肿瘤细胞株捕获率，Chen等设计的DLD芯片在1mL/min的通量下可实现95%的肿瘤细胞株捕获率。生物学特性的分选主要是根据免疫亲和反应将CTC捕获，其中最常见的是“人字”芯片或“HB芯片”，HB芯片是在普通芯片的基础上通过人字形微柱的设计，使血样流经芯片时产生微量涡流来实现血液细胞的被动混合，以显着增加目标CTC和抗体包被芯片表面之间的相互作用次数，显著提高CTC的分离效率。Shannon等设计了人字形鱼骨芯片，在流速(0.12 mL／h)下可实现79%±4.5%肿瘤细胞捕获效率及50%左右捕获纯度。Nagrath等将anti-EpCAM抗体包被在芯片微柱上，通过肿瘤标准细胞株检测，实现99%的高捕获效率及47%的捕获纯度。以上研究提示，应用微流控芯片技术有望克服CTC检测技术的不足，实现高效、高特异性的CTC检测，但是目前大多研究是在细胞株水平进行的，对患者外周血CTC检测的研究尚不足。

因此，应用微流控芯片技术，国内某研究小组构建了适于肺癌CTC检测的装置，并将该装置用于患者外周血CTC检测。该装置联合了DLD分选平台、磁场负性分离纯化平台及免疫亲和捕获平台，以实现高效的、高特异性的CTC检测。应用该装置，国内某研究小组分别对标准细胞株、肺癌患者CTC进行检测，并与CTC检测金标准CellSearch System的检测结果进行了对比。标准细胞株的检测结果提示该装置可实现90%以上的检测效率及50%的检测纯度，且该装置对细胞的活性无明显影响，可用于下一步的相关分析。肺癌患者外周血CTC的检测结果进一步证实了装置具有良好的检测效能。芯片装置与CTC检测金标准CellSearch System对30例肿瘤患者外周血CTC检测结果提示二者在检测效能上无明显差异，但是在检测所需标本量、检测时间、检测成本、临床普及性等方面，芯片装置具备明显的优势。以上实验证实了芯片装置具备良好的CTC检测效能，可用于临床CTC检测。因此，国内某研究小组应用该装置对55例肿瘤患者外周血CTC进行检测，分析了CTC数目与肿瘤分期、肿瘤转移及患者病情的关系，检测结果提示CTC数目与肿瘤分期相关，早期（I、II）患者，检测结果为阴性，晚期患者（III、IV），检测结果通常为阳性，且随着分期的增高，检出阳性率逐渐升高。而且检测结果与肿瘤转移相关，检测结果为阳性的患者通常已出现转移，而未出现转移的患者，检测结果为阴性。另外，检测结果与患者病情相关，对于病情复发或进展的患者，检测结果通常为阳性，对于病情缓解或稳定的患者，检测结果为阴性。综上所述，应用微流控芯片技术，我们课题组成功构建了CTC检测装置，可用于肺癌患者的CTC检测，且检测结果有助于临床肺癌分期、转移状态评估、患者病情分析及治疗方案的选择。

随着精准医学时代的到来，肺癌的诊治正在一步步向精准化、个体化、综合化的治疗方向发展。而这种发展方向是有原因的，首先，肺癌是一种基因疾病，多样且复杂，即使在显微镜下形态一致的肿瘤，在临床上却可能有着截然不同的疗效以及预后；其次，肺癌本身在分子遗传学上具有异质性，并且随着疾病的进展处于不断演化的状态；最后，因为肺癌治疗药物价格高昂，不恰当的治疗将会给病人甚至是整个社会造成沉重的负担和资源浪费。由此肺癌精准医疗应运而生，CTC检测这一液体活检技术的到来，为肺癌精准医学的实现带来了新的希望。最近，已经有大量针对CTC的分子研究，从富集的CTC群体中提取细胞DNA和RNA进行深入的基因组学分析，但由于CTC的富集过程存在白细胞的污染，所以分析结果缺乏准确性。例如，Punnoose等人分析了CellSearch®在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中富集的CTC中的EGFR突变状态，在肿瘤活检确认携带EGFR突变的8例患者中只有一例可检测到基因突变。随着研究的进展，单个CTC的基因组分析克服了白细胞污染所造成的限制，能够评估单个CTC之间的异质性并有助于鉴定细胞内共存的突变。而且CTC单细胞基因组测序分析可从分子水平明确肿瘤发生、发展、转移及耐药的机制，从而实现精准医疗。单细胞的分选方法主要包括显微镜下手动毛细胞吸取法、阻抗脉冲信号芯片捕获法、阵列芯片分选法等。目前，我们课题组正致力于肺癌CTC单细胞的相关研究，通过基因组测序技术，分析肺癌CTC异质性，深入探究肺癌发生、发展、转移及耐药的机制，为肺癌精准医疗提供新的思路。

综上所述，CTC检测作为一种液态活检技术有望克服临床肺癌诊断低的难题，CTC检测有助于肺癌分期、转移预测、治疗方案选择及预后评估。应用微流控芯片技术可实现高效的、高特异性的CTC检测。CTC捕获后的单细胞测序分析可从分子水平揭示肺癌的本质，深入探讨肺癌发生、发展、转移及耐药的机制，从而制定个体化治疗方案，实现肺癌精准医疗。