实用哺乳动物细胞培养手册（一）

细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒

清洗

在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器 皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同 的清洗方法。

玻璃器皿的清洗

组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。

（1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被 溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有 大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不 能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的 杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清 洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器 皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于 6 小时。 清洁液可根据需要，配制成 不同的强度，常用的下列三种： 重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）（A）强 清洁液 63∶1000∶200000（B）次强清洗液 120∶200∶1000（C）弱清洁液 100∶100∶100。

清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒 搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。

（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗 3-5 次，晾干备用。

胶塞的清洗

细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先 用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸 10-20 分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用 1% 稀 盐酸浸泡 30 分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸 10-20 分钟，晾干备用。

塑料制品的清洗塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用 2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用 5% 盐酸溶液浸泡 30 分钟， 最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

消毒

细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是 由于操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底。由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。 消毒方法分为三类：物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤、过滤等），化学灭菌法（各种化 学消毒剂）和抗生素。

（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线 直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外 线灯应距地面不超过 2.5 米，且消毒进物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作 用。紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不 宜近照射。

（2）温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。温热消毒时， 消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。 在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气 阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。 消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及表皮意外事 件发生。

常用物品消毒压力及时间：

培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃, 15 磅, 20 分钟；

布类、玻璃制品、金属器械等物品：先 121℃, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干；

玻璃瓶：干热灭菌 170℃, 4 小时。

（3）化学消毒法：最常见的是 70% 酒精及 1‰ 的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤， 操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消 毒。化学消毒法操作简单、方便有效。

（4）抗生素消毒：主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。

细胞培养常用物品

细胞培养基

目前，市场上可提供干粉培养基和液体培养基。干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制。液体培养基是由专业产家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便。

血清（略）

平衡盐液体

PBS（Phosphate-Buffered Sallines）

DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）标准型

Hanks’ 平衡盐溶液（Hanks’ Balanced Salt Solutions，HBSS）

D-Hanks’ 平衡盐溶液 (D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)