细胞培养的注意事项（二）

13.如何选择正确的血清种类？

14.可否使用与原先培养条件不同的血清种类？

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

15.血清灭活是否必须？

这个问题现在有争议。有人主张价格不菲的血清中含有诸如生长因子，维生素，氨基酸等珍贵物质，而将它们置于50℃以上的温度长达30分钟的热处理会对血清中的生长因子，氨基酸等成分带来的负面影响。尽管如此，在大多数实验室之中血清的热灭活还是作为常规来执行，尤其是在昆虫细胞和胚胎干细胞培养中。

16.培养基中是否添加抗生素？

除特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

17.何时更换培养基？

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。

四、细胞传代

18.细胞传代的方法都有哪些？

根据不同的细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。

19.原代培养的首次传代应注意的问题？

细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代；原代培养时细胞多为混杂生长，不同的细胞有不同的消化时间，因此要根据需要注意观察及时处理，并根据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间而分离和纯化所需要的细胞；

吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤；首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增值；随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。

20.使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的？应如何处理？

EDTA作用较胰蛋白酶缓和，主要作用在于能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要因素。但EDTA单独使用不能使细胞完全分散，因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果较好。常用比例为1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液浓度为0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在终止消化前，需用缓冲液将消化液清除后才能加培养液。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 –20 ℃，避免反复冷冻解冻造成胰蛋白酶的活性降低，并可减少污染的机会。

21.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞，其离心速率一般为800~1000 rpm，5~10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。

22.细胞的接种密度为何？

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。

23.细胞交叉污染的可能原因？

多种细胞系进行维持传代操作时，各细胞系所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。

五、细胞冻存

24.冷冻培养基为什么要加DMSO？

因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冻存时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将造成细胞损伤，还可引起细胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保护剂。这两种细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高包膜对水的通透性。

25.DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？

冷冻保存使用的 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4 ℃，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。

26.欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。

27.冷冻保存细胞的方法？

冷冻保存方法一：冷冻管置于 4 ℃ 30~60 分钟 →-20 ℃ 30 分钟 → -80 ℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 长期储存。

冷冻保存方法二： 冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

28.细胞冻存太多会不会浪费？

每一种细胞系都应有充足的冻存储备，防止由于细胞污染等因素造成的细胞系的绝种，而且每一批次培养的细胞状态都不同，应该挑选几个状态较好的批次冻存保种。另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或者发生改变。

29.如何识别和预防常见的细胞污染？

之前ESCO生命科学发过题为《细胞污染过程中常见的微生物污染和预防》一文，详细介绍了细胞是何种生物性污染的判别方法及预防细胞污染的详细方案，如果感兴趣的话可以点击阅读原文展开了解，或者关注ESCO生命科学的微信公众号：Esco_China,进一步了解更多关于细胞培养的相关内容。