蛋白分离、杂交、检测、分析
前瞻回顾
鉴于小编在《Azure Biosystems Western Blotting工作流程之实验方法的选择》中和大家聊了Western blot的实验方法选择，相信大家已经将您的western blot 实验方法选择好了，那么这期小编和大家聊聊western blot的实验流程中的那些事。
蛋白分离
电泳准备？
玻璃配胶板要清洗干净，以免引起配胶问题，影响蛋白分离
配胶液要充分混匀，凝聚时间要够，如胶凝聚不均匀，会造成胶分辨率差。出现笑脸皱眉条带
电泳时，上样体积和浓度最好保持一致，这样可以防止出现条带过宽或者过窄的情况产生
如何选择膜？
膜上有蛋白质的结合位点，可结合从凝胶中转移的蛋白质。常用的膜是硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。
NC膜
低分子量蛋白检测
通常用于化学发光法
蛋白剥离效果不理想
PVDF膜
低表达蛋白结合能力强
通常用于荧光方法（自发荧光背景低）
剥离和二次杂交时，蛋白的截留能力强
如何建立转膜系统
常用的转膜系统形式为 “三明治” 结构，凝胶和膜紧密贴合，放在两张转印滤纸之间，用电极板夹夹住，置于转印buffer中，正负电极通电后，将蛋白质从凝胶转移到膜上。转印滤纸 （滤纸） 能够保持均匀一致的压力，确保膜和凝胶间没有空隙，并保持转移buffer充盈在“三明治”结构中蛋白完全从凝胶转移至膜上。
Blot前准备什么？
当优化转印设置、条件及实验时，最重要的是确定样品中所有蛋白是否从胶上完全转移到膜上。使用SelfStainTM免染胶来显示膜上的所有蛋白 ，并立即进行western blot后续步骤。 
膜封闭
封闭目的是防止非特异性结合，降低背景对目的信号的干扰。如使用脱脂奶粉做封闭液，最好将脱脂奶粉进行滤膜过滤，这样可以减少后期颗粒背景的产生。
一抗孵育
确保新的一抗浓度经过优化。如有确证过的一抗，可尝试将一抗标记荧光染料，直接进行一步法Western blot检测。
洗膜和二抗孵育
每次孵育后，洗去多余的抗体对于降低背景信号至关重要。荧光方法Western blot中，洗膜还可以去除有自发荧光的去垢剂。洗膜的时候如果多张，建议分开进行清洗，同时洗膜液体积不能太少。
化学发光检测
尝试不同的底物增加灵敏度和信号持久性；化学发光底物使用前需要平衡至室温，可以增加酶的活性；数字成像系统要灵敏度很高。
荧光检测
保持所有物品的清洁，确保无背景干扰；印迹膜避光保存；使用背景淬灭板降低背景荧光，增强信噪比。
检测
Azure Biosystems c系列成像系统
Azure c 系列成像系统提供 4 款性能卓越的 Western blot 成像系统。可以选择满足现有实验需求的型号，当需要提升应用范围时，通过升级即可完成
