Genome Research丨lncRNA在精子发生过程中发挥重要作用
一直被很多科学家认为是真核生物基因组进化中“垃圾”信息的非编码RNA（ncRNA），既不编码蛋白质，又缺乏生物学功能的遗传学证据，近几年得到了“平反”，越来越多的研究表明ncRNA 在剂量补偿效应(Dosage compensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。
随着高通量测序技术发展，越来越多的lncRNA被证明在睾丸和脑组织中呈现高度特异性表达，这暗示着在精子发生与神经调控两个基础生命学过程中，lncRNA的功能机制具有代表性。
清华大学高冠军实验室于2016年9月1号在Genome Research正式刊发题为《Critical roles of long noncoding RNAs in Drosophila spermatogenesis》的文章。此文章详细阐述了lncRNA在精子发生过程中的重要作用，为揭示“暗物质lncRNA”具有重要生物学功能提供了大量的遗传学证据。
高冠军研究小组选择基因强净化的模式生物果蝇为代表，通过高通量遗传动物模型的建立，鉴定了128个睾丸特异性表达的lncRNA。然后运用优化后的CRISPR技术建立了105个lncRNA基因敲除体。通过观察并分析雄性果蝇精子发生、发育、活力等，发现近1/3的lncRNA基因的缺失会导致精子发育异常甚至完全不育。
图1 剔除研究的睾丸特异性lncRNA的鉴定和选择的流程图。使用生物信息学和在FlyBase中注释的lncRNA的分析的新型lncRNA组合以构建lncRNA起始库。然后，通过睾丸特异性表达筛选和RNA原位杂交，选择128种睾丸特异性lncRNA候选物用于靶向敲除。这些lncRNA位于三个不同的染色体上，包括染色体2的左臂和右臂，染色体3的左臂和右臂和染色体X。
图2 lncRNA突变体导致雄性特异性生育缺陷。 （A）105个lncRNA突变体的生育概况。 （B）删除lncRNA CR44455 / 6导致雄性不育，而CR44455 / 6 - / - 雌性完全能育。 （C）对CR42858 - / - 的雄性和雌性突变果蝇进行定性生育力测定。 删除CR42858大大降低了雄性的生育力，但雌性不受影响。
而通过异位转基因方法发现，lncRNAs敲除的果蝇可以完全或部分修复异常，表明这些lncRNAs主要以反式（trans）发挥作用。高冠军小组还通过基因表达谱分析得出，大部分功能性lncRNAs在精子发生过程中调控全局基因的表达。进化分析表明，相比起编码基因，lncRNAs演化更快，且具有更大功能重要性的lncRNAs具有较高的序列保守性，暗示它们处于不断的进化选择之下。与蛋白编码基因的开关调控作用不同的是，lncRNA可能多通过微调的方式调控全局基因表达，从而影响雄性生殖细胞分化。
高冠军小组的这个研究意义在于弥补了大量功能性lncRNA在动物活体水平所缺乏遗传学证据的空白，开启了lncRNA所传递的生命信息研究的大门。接下来为大家附上这篇文章的摘要。
摘要：
Long noncoding RNAs (lncRNAs), a recently discovered class of cellular RNAs, play important roles in the regulation of many cellular developmental processes. Although lncRNAs have been systematically identified in various systems, most of them have not been functionally characterized in vivo in animal models. In this study, we identified 128 testis-specific Drosophila lncRNAs and knocked out 105 of them using an optimized three-component CRISPR/Cas9 system. Among the lncRNA knockouts, 33 (31%) exhibited a partial or complete loss of male fertility, accompanied by visual developmental defects in late spermatogenesis. In addition, six knockouts were fully or partially rescued by transgenes in a trans configuration, indicating that those lncRNAs primarily work in trans. Furthermore, gene expression profiles for five lncRNA mutants revealed that testis-specific lncRNAs regulate global gene expression, orchestrating late male germ cell differentiation. Compared with coding genes, the testis-specific lncRNAs evolved much faster. Moreover, lncRNAs of greater functional importance exhibited higher sequence conservation, suggesting that they are under constant evolutionary selection. Collectively, our results reveal critical functions of rapidly evolving testis-specific lncRNAs in late Drosophila spermatogenesis.
高冠军简介：
高冠军博士，清华大学生命科学学院 PI，博导。2005年6月获浙江大学生物物理学博士学位。2011年至今被清华大学生命学院聘为PI和博士生导师。目前，通过运用实验室在国际上率先建立的CRISPR与phiC31重组酶相结合的高效果蝇基因打靶系统（knock-out和knock-in），综合运用遗传与生化相结合的方法与技术，规模化研究染色质表观遗传学相关因子（如非编码RNA及组蛋白修饰等）在生殖系统及胚胎早期发育进程中的生物学功能及相应的分子作用机制。研究成果多次发表在Nature、Genome Research、PNAS、EMBO J、Genetics、G3：Genes|Genomes|Genetics、Nature Microbiology等国际学术期刊上。
