ELISA常见问题及解决方案

一．背景高或者非特异性染色

原因

解决方案

抗体的非特异性结合

更换封闭液（例如，使用酪蛋白替代BSA）；封闭结束后不要清洗；倒出封闭液，吸水纸上吸干残留液体后直接进行下一步。

未充分清洗酶标板

确保在清洗过程中每个微孔都充满缓冲液、清洗仪器正常工作。各步骤之间清洗3~5次，不要增加清洗次数。清洗完成后，将酶标板用力按压在纸巾上，以除去残余的缓冲液。清洗溶液中应添加适量的Tween-20（推荐浓度0.01-0.1%）。

缓冲液被污染

缓冲液应新鲜配制，一周内使用，并过滤除菌。

孵育温度太高

整个实验过程应在室温25℃。

孵育时间过长

缩短孵育时间

酶标记物污染了底物或者阳性对照污染了微孔

吸取不同的试剂时应更换吸头，并使用不同的贮液器。最好用移液器加入或去除清洗缓冲液（倒入/倒出可能导致交叉污染）。

检测抗体或Avidin-HRP的浓度过高

检测浓度计算是否正确，或者进一步稀释后再使用。

底物在使用前曝光

在将底物加入到微孔中以前，应始终避光保存

读取吸光值时使用了错误的滤光片

ABTS为底物时应在405nm波长读取吸光值（TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值），并以650nm作为校正波长。

显色时间过长

每5分钟读取一次吸光值，以监测空白孔的O.D.读数。

二．显色弱或者不显色

原因

解决方案

遗漏了某种试剂或某个步骤

查看实验方案，严格遵循实验操作步骤。

清洗缓冲液中的去污剂浓度过高

去除或降低去污剂的浓度，推荐0.01-0.1%

酶标板未适当清洗

减少各步骤之间的清洗次数，尤其是当未使用全自动或半自动洗板机时，清洗1-2次即可。

样本中存在酶抑制剂

叠氮钠抑制了过氧化物酶的活性。

孵育时间或温度错误

孵育期间应将酶标板放在孵育箱（25℃）内，以免出现温度波动

加入微孔中的底物量有误

检查移液器

酶-底物系统不合适

Avidin-HRP和ABTS配对使用，Streptavidin和TMB配对使用

试剂盒内的组分储存不当

按说明书要求储存各组分

读取吸光值时使用了错误的滤光片

ABTS为底物时应在405nm波长读取吸光值（TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值），并以650nm作为校正波长

三．标准曲线不佳

原因

解决方案

标准品配制有误

使用推荐的稀释缓冲液对标准品进行稀释

过早稀释

使用前再配制各种试剂，并尽快使用

捕获抗体无法包被

使用适合做ELISA的板，不能用细胞培养板

清洗不充分

每个微孔中应加入等体积清洗液，确保所有微孔均可被抽吸干净，并及时填充。

移液出错

校正移液器，快速、等量的将移液器中的试剂沿微孔的侧壁加入

显色时间过长

空白孔的O.D.读数不超过0.2或最高浓度标准品孔的O.D.读数不超过1.2。

试剂盒内的组分储存不当

按说明书要求储存各组分，不要将重悬后的试剂在室温放置时间过长。

四.精确度较差

原因

解决方案

试剂混合不充分

移液前，充分混合试剂

清洗不充分

每个微孔中应加入等体积清洗液，确保所有微孔均可被抽吸干净，并及时填充。

移液出错

校正移液器，快速、等量的将移液器中的试剂沿微孔的侧壁加入

耗材重复使用

吸取不同样本时应更换吸头；不同的试剂使用不同的贮液器；个孵育时段内应用新的密封片封板。

微孔被吸头或洗板机划伤

吸液、加液时小心操作

样本中存在沉淀物

使用前应离心样本管

微孔不干净或存在污垢

使用前仔细检查微孔，并清除污垢。读取吸光值前，请擦拭酶标板的底部，以去除污垢或指纹。

五.边缘效应

原因

解决方案

蒸发

每个孵育步骤都应使用密封片封板

温度不均匀

孵育期间应将酶标板放在孵育箱（25℃）内，以免温度波动，请勿堆叠酶标板。