干扰素的制备及检测实验

实验原理

干抗素是干扰素诱生剂作用于有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能蛋白质。它从细胞产生和释放出来以后，又作用于相应的其它同种细胞，使其获得抗病毒及抗肿瘤等多方面的免疫力。

所谓干扰素诱生剂，是指能诱导有关生物细胞产生干扰素的一类物质。能诱导有关生物细胞产生α和β干扰素者称甲类干扰素诱生剂，如各种动物病毒、细胞内寄生的微生物等；可诱导T细胞产生γ干扰素的称为乙类干扰素诱生剂，如脂多糖、链球菌毒素、肠毒素A等。

在实际工作中，制备干扰素多采用两种方法。一是用干扰素诱生剂诱导某些生物细胞产生干扰素，经提取纯化并检定合格后即可使用。该法所用的细胞多为外周血白细胞。二是采用基因工程法进行生产，即将干扰素基因导入大肠杆菌内，通过培养大肠杆菌来生产干扰素。目前，大规模生产干扰素主要采用基因工程法。

实验设备

细胞培养设备(如培养瓶、多孔培养板、温箱、显微镜、旋转培养器等)、水浴箱等。

实验步骤

1. 制备诱生剂：采用NDVF系弱毒株，以鸡胚尿囊液形式保存于-20℃，

其血凝滴度稳定在1:640～1:1 280之间。大量繁殖时，用0.5%水解乳蛋白稀释100～1 000倍，接种于9日龄鸡胚尿囊腔，置37℃培养72h后，收获尿囊液，效价测定应大于1:640，无菌检查应合格。

2. 制备诱生细胞：无菌采取人外周血(多用人脐带血，或血库贮藏血)，置于含肝素的无菌瓶内，于4℃保存不超过24h，诱生细胞(白细胞)不单独提取，以全血代替。

3. 制备粗制干扰素：

1) 加诱生剂，按1ml抗凝全血加0.2ml诱生剂(即NDVF系尿囊液，其血凝滴度不低于1:640)；

2) 加温吸附，将加有诱生剂的抗凝全血置37℃水浴中1h，每隔15min晃动一次，使NDVF吸附于白细胞上。然后以1000r/min离心20min，弃上清，留沉淀物；

3) 加营养液孵育诱生，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle营养液于上述沉淀物中，混匀，置35～36℃温箱内旋转培养18～20h；

4) 离心及酸处理，将上述培养物以2000r/min离心30min，取上清，以6mol/L盐酸将其pH值调至2.0，置4℃冰箱5天灭活NDV；

5) 中性化，经5天酸化后，再用6mol/L氢氧化钠将pH值调至7.2～7.4，即为粗制干扰素。

4. 制备精品干扰素：

1) KCNS沉淀，取上述粗制干扰素，加KCNS并用2mol/L HCl调pH值为3.5，然后以2 000r/min离心30min取沉淀；

2) 酒精提取，将沉淀溶于95%酒精(预冷至-20℃)，用2mol/L NaOH调pH值为4.2，以2 000r/min离心30min取上清；用2mol/L HCl调pH值至3.5，离心后取上清，再将pH值调至5.6，离心后取上清，最后将pH值调至7.1，离心后取沉淀；

3) 过碘酸钠沉淀，将沉淀溶于PBS中，加过碘酸钠，并调pH值为4.5，用50%乙醇10倍稀释，离心后取上清，将上清液对0.3mol/L (NH4)2CO3(pH值7.6)在4℃下透析过夜。

4) sephacryl S200柱层析：将sephacryl S200按要求处理后装柱(4～5×100cm柱)，用PBS平衡后，加样(即上述上清液)，用洗液洗脱。洗脱期间用核酸蛋白仪连续检测，收集相应峰即为精制干扰素。取样进行效价测定，按结果进行稀释，分装并冻干。

5. 检定

1) 效价测定

a. 制备攻击病毒：将水泡性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维母细胞上传代后，

再在猪细胞(IBRS)上传3～5代，使其对IBRS有良好致病效应，其TCID50应稳定(一般在10-6～10-7之间)。

b. 准备测定细胞：生长良好的幼龄IBRS单层细胞。

c. 测定：取上述单层细胞分为若干组，每组加不同稀释度的干扰素，置37℃孵育20～24h，然后每管均用100个TCID50的VSV攻击，置37℃ 48～72h孵育后，观察结果。同时设细胞对照组和病毒对照组。病毒对照组CPE＞75%，正常细胞对照组CPE=0，即认为该测定系统有效。干扰素判定标准是以能保护半数细胞免受攻击病毒损害的干扰素最高稀释度的倒数作为干扰素的单位。

2) 酸碱度测定

取本品10支，加水溶解，精密测量pH值应为6.0～7.5。

3) 水分测定

按磺硫溶液法测定，不得超过3%。

4) 安全试验

取本品加水溶解，小鼠尾静脉注射，48h内不得有死亡。

5) 热原检查

取本品1支，加水溶解，依法检查，应符合规定。

6) 菌检

取本品3支，无菌水溶解，分别接种到检查需氧菌、厌氧菌及霉菌用培养基上，37℃培养1周，应无菌生长。

7) 超敏反应

取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品适量，连续3次，于20天后再于耳静泳注入本品适量，应无过敏反应现象发生。

注意事项

1. 制备NDVF系弱毒诱生剂时，种毒应无菌检查合格，且滴度在1:640以上。收毒时，应将污染的鸡胚弃去。

2. 不必从血液中将白细胞提取出来，因红细胞对白细胞产生干扰素有营养作用。纯化的白细胞产生干扰素效价不一定高。

3. 酸化的目的是杀死其中的诱生剂NDV，而在pH值20时，干扰素是稳定的。

4. 在常温下干扰素半衰期很短。故各种操作要在低温环境下进行，动作要迅速，纯化所用试剂要作预冷处理。干扰素粗品及精品要及时置低温下存放。效价测定时，干扰素应于临用时现溶解。