【摘要】 目的 研究神经干细胞 (NSCs)移植对改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (H I BD)后感觉运动障碍的作用。
方法
7d龄新生SD大鼠,随机分为假手术组, HIBD组和脑内移植组 ,后两组 H I BD损伤后3 d分别在左侧感觉运动皮质区植入BrdU标记的
NSCs或培养基作为对照 ,观察植入 4周后大鼠感觉运动功能的变化和移植细胞在脑内的存活和分化情况。结果 与 H I BD组比较 ,移植组在
T迷宫和四项感觉运动功能测试中,表现出明显的改善。在T迷宫中,自发改变率(69.23±13.34) % vs (45.00±27.27)%]
(P<0.05)上升;在握持牵引试验中 ,握持时间明显延长 [ (49.15±13.39) s vs (27.20±15.18) s ] (
P <0.05) ;在肢体放置和足错误试验中的不对称性消失 ,姿势反射也明显改善 ( P < 0 . 05
)。BrdU间接免疫荧光显示移植后 4周 ,在脑内可见存活的 NSCs分布于移植点附近; BrdU和 NF2 200免疫荧光双标显示移植后4周
NSCs可部分分化为神经元表达 NF2 200。 结论 脑内移植 NSCs对 H I BD新生大鼠的感觉运动机能和行为的恢复有良好的促进作用。
【关键词 】 神经干细胞; 移植; 感觉运动; 缺氧缺血; 大鼠
新生儿缺氧缺血性脑病
(H IE)的病死率高 ,预后差,可产生永久性神经功能障碍。目前对新生儿 H IE的治疗仅局限于支持疗法 ,尚无促进神经再生的手段[ 1
]。目前 ,在使用神经干细胞 (NSCs)移植治疗缺氧缺血性脑损伤 (H I
BD)的动物实验和临床实验中,均已取得了一定的疗效[2]。但是这些研究结果大多来自于成年动物和成年人,NSCs移植能否改善新生大鼠HIBD后的感觉运动障碍尚未见报道。本研究探讨脑内移植胚鼠
NSCs对新生大鼠 H I BD后感觉运动功能的影响。
材料和方法
一、 材料
SD大鼠
(清洁级)。DMEM /F12 ( 1: 1 )、 B27 ( Gibco ) , bFGF、EGF ( Pep r oTech EC)。抗
NF2 200、 抗 B rdU (NeoMarkers)。大鼠脑立体定位仪, T迷宫、 常压缺氧舱均为参照文献自制。
二、 胚胎 NSCs的分离、 培养、 B rdU标记及收集
取孕
14 d S D大鼠的胚胎 ,分离前脑皮质组织 ,胰酶消化吹打制成单细胞悬液后接种于含 10 ng/mlbFGF和 20 ng/ml EGF的
DMEM /F12培养基 (另含 B2720μl /ml)中培养 ,每 2～3 d半量换液 1次。移植前3 d,将准备移植的 NSCS换液
,同时在培养基内加入 B r2dU孵育 ,终浓度为 10μmol /L。收集在体外稳定传代培养 1月并经 BrdU标记的
NSCs备移植用。4%台盼蓝染色细胞计数 ,活细胞 > 95% ,调整活细胞密度为 5×104个细胞 /μl,置冰上备用。
三、 实验动物分组
新生7d龄SD大鼠,共35只,随机分为假手术组( Sham, n = 10),HIBD+培基移植对照组 (HIBD, n=12) , H I BD+NSCs移植组 (NSCs,n = 13)。
四、 H I BD模型制作
参照Rice方法[3],7d龄SD新生鼠乙迷麻醉后分离出左颈总动脉并结扎,休息2 h后,将大鼠置于有机玻璃低氧舱内,氧浓度在8%(7%～9%) ,舱内温度控制在(36±2)℃,湿度为70% ±5% ,缺氧时间持续
2 h。实验结束后将大鼠放回鼠笼由母鼠行母乳喂养。
五、 脑内移植
HIBD损伤后3d,低温麻醉后,将动物固定于立体定位仪 ,以左侧感觉运动皮层区(坐标AP:+ 0. 3mm,ML:-2mm, DV:-1.5mm)为移植点 ,使用微量进样器缓慢注入 2μl NSCs细胞悬液或培养基。
六、 大鼠感觉运动功能的检测
42 d龄时测试。参照 Bona[ 4 ]方法,包括4个试验。行为学测试均按盲法进行。
1 .握持牵引试验:大鼠用前爪抓住离桌面45cm水平放置的直径为0.6 cm的空心塑料管悬挂,记录其悬挂的时间(最大值为60 s,超过60s按60s计)和右侧(缺血对侧)后肢能否放到管子上。
2 .足错误试验:记录大鼠在水平放置的网格上(50cm×40 cm,每格3cm×3cm) 2min内前、后肢或爪子掉下来的次数 ,为排除不同大鼠活动度的差别的影响,只将左右侧错误次数的差值进行统计学分析。
3
.姿势反射试验:抓住大鼠的尾巴 ,使之悬挂于距离桌面 50
cm高处。正常鼠将两个前肢都伸向桌面(0分,而有脑损伤的大鼠损伤大脑半球对侧的肢体呈屈曲状(1分)
,然后将大鼠放在桌上,在肩后的侧面加压直到前肢伸直 ,重复数次 ,如果朝右侧 (损伤大脑半球的对侧 )的抵抗力减弱为异常 (2分)。
4 .肢体放置试验:记录大鼠在 6种不同的感觉刺激下左右侧前后爪的放置情况 ,记录每只鼠两侧得分的差值。计分标准如下: 0分 ,爪子放置正确、 迅速; 1分 ,迟缓或不完全正确; 2分 ,未放置。
七、 T迷宫自发交替及强迫改变
参照 Balduini[ 5 ]方法。
1 . T迷宫自发交替:自 28 d龄起检测。检测动物在 T迷宫内连续测试中进入不同臂的趋势。每只动物连续测试 3 d,每日 1次 ,每次给两次改变方向的机会,结果分别记录为改变率 0% , 50% ,或 100% ,同时记录进入左右臂的次数。
2
. T迷宫强迫改变:自32d龄起检测。测试分为两个阶段,预测试和测试。预测试时,动物被迫只能进入开放的臂内,并将食物吃完
,然后将之放入起始臂内,关15 s后撤去所有的闸门开始测试。如果动物进入预测试时未进入的臂内 ,记录为正确;如果进入预测试时已进入的臂内
,记录为错误。每只动物每日测试5次 ,每次间隔 15min,连续 4 d,共 20次。
八、 免疫荧光染色
根据使用说明书进行 nestine、 BrdU和 NF2 200单染或双染操作。
九、 统计学分析
计量数据以x±s表示,数据均用SPSS11.0统计软件包进行统计。
结 果
一、 NSCs的生长情况及鉴定
原代培养细胞24
h内就可以形成由2～3个细胞组成的小细胞团,即原代克隆,7d时生长为数十个细胞到数百个细胞的克隆 ,悬浮生长
,呈球形。传代后出现与原代培养相同的大量次代克隆,5～7d可再次传代。间接免疫荧光细胞化学染色发现,NSCs标记蛋白nestin在各级克隆中都有表达。
二、 神经功能评价
1
. T迷宫自发交替试验:HIBD组的大鼠选择左侧(缺血侧) >右侧,差异有显著性意义(P<
0.05)。21T迷宫强迫改变:随天数的增加,Sham组与NSCs组的正确率日渐增加,而HIBD组的正确率上升不明显
,说明学习能力较差。NSCs组的正确率较HIBD组有明显增高 ,差异有显著性意义 ( P < 0 . 05)。3 .感觉运动功能测试:
NSCs组的握持牵引时间较HIBD组延长( P<0.05)。足错误试验中,
NSCs组的足错误次数右2左差值较HIBD组减少(P<0.05)。在姿势反射测试中,NSCs组的正常率较HIBD组明显增加(P<
0.05)。在肢体放置试验中,NSCs组右-左的得分较HIBD组明显减少(P<0.05)。41NSCs移植后检测: NSCs移植 1月后
,均可见不同程度的 BrdU阳性细胞沿针道分布 ,大量分布于移植点周围 ,向脑实质内扩散 ,随与移植点距离的增大阳性细胞逐渐减少。B
rdU和NF2 200的免疫荧光双标显示部分BrdU阳性细胞同时也表达神经元特异性抗原NF2
200,提示NSCs移植到大鼠脑内1月后可分化为神经元。
讨 论
研究表明
,移植 NSCs入发育的大鼠脑内
,细胞广泛迁移,其分化结果与移植的部位有关。说明在体外扩增后,由NSCs分化的神经元保持了对新生鼠脑结构识别与定位的反应能力[ 6
]。但是移植NSCs到成年动物的脑内,仅在神经发生的部位,如海马才能分化为神经元,而在非神经发生的部位如小脑、纹状体和脊髓则主要分化为胶质细胞[7
]。干细胞移植后的迁移能力和与宿主神经细胞整合能力也随年龄增长而逐渐下降[ 8 ],而且新生大鼠免疫机能不完善
,脑内移植后宿主的排异反应相对较小。由此可见成年期和新生期的宿主对移植的
NSCs的反应是不同的,干细胞移植治疗新生儿脑损伤性疾病较成人更有前途。本实验结果显示,从大鼠14d胚胎前脑皮质组织中分离出来的NSCS在生长因子EGF和bFGF存在的条件下可长期维持未分化状态并不断增殖
,在撤除生长因子后,可分化为神经元和胶质细胞,具备了NSCS的基本属性。将NSCs移植到新生大鼠HIBD模型的感觉运动皮质区,可有效的改善HIBD所致的感觉运动障碍,在握持牵引测试、姿势反射、足错误试验和肢体放置试验中的成绩较对照组明显提高;同时还有效的改善空间认识和学习记忆缺陷
,在 T迷宫强迫改变试验中的正确率增加。移植后 4周 ,所有的移植治疗大鼠在移植部位都可见到存活的细胞 ,沿移植点向远处迁移。本研究将
NSCs移植到感觉运动皮质后,能有效地改善其感觉运动缺陷,其机制可能与神经重建有关,免疫荧光双标也显示部分
BrdU阳性细胞同时也表达神经元特异性抗原NF2200,提示NSCs移植后可分化为神经元 ,可能是其发挥治疗作用的机理之一。结果提示,
NSCs移植到新生大鼠 H I BD后的脑内 ,不仅能存活
,还能很好的与宿主脑组织整合并迁移,并可改善其远期的学习记忆、空间辨别能力和感觉运动功能。为 NSCs移植治疗新生儿 H IE提供了实验依据。
