肝脏细胞RNA的提取操作方法

一．原理

RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组 学科研技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制，已成为分子生物学研究的一个重要手段。对某一生物或组织进行性状研究，首先要获得该性状基因，从组织细胞中分离完整的RNA对于分子克隆 和基因表达分析等实验是至关重要的，如Northern印迹及杂交分析、cDNA合成等实验的成效在很大程度上取决于RNA的质量。利用提取的RNA人们可以对特定的基因表达进行定量的检测，从分子水平精确的了解细胞生命活动的规律。通常一个典型的哺乳动物细胞约含有10-5μgRNA ，其中80%～85%为rRNA（主要是28S、18 S和5.8 S、5S四种类型）；10%～15%为tRNA和核内小分子RNA。

这些高峰度的RNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。相反，占RNA总量1%～5%的为mRNA 。mRNA 虽然大小和核苷酸序列各不相同，从数百至数千碱基不等，但大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)组成的尾，其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸―纤维素[oligo(dT)] ，使得mRNA可以利用亲和层析法分离。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。研究表明RNA极不稳定，易于降解，而RNA酶几乎无处不在，且特别稳定，故在提取RNA时关键因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力，因此，创造一个无RNA酶的环境，严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。

对内源性RNA酶，主要运用RNA酶抑制剂，目前常用的RNA酶抑制剂有：

①RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin)，它是从人胎盘分离的一种蛋白质，可以与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的复合物，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白质抑制剂制品经数次冻融后或放在氧化条件下应弃之不用。RNA酶的蛋白质抑制剂不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译；

②氧钒核糖核苷复合物，它是由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态似物，它能与多种RNA酶结合并高效抑制RNA酶活性。然而氧钒核糖核苷复合物能强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1%羟基喹啉的苯酚多次抽提以除之；

③硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后续的RNA纯化过程中经离心除去；

④异硫氰酸胍，它是强力的蛋白质变性剂，在破坏细胞结构使核酸从细胞核中解离出来的同时也使RNA酶变性失活；

⑤焦碳酸二乙酯(DEPC)，它是RNA酶强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的。DEPC主要用于不能高压灭菌的材料和器皿的RNA酶处理；

⑥其它化学试剂，如SDS、尿素等对RNA 酶也有一定的抑制作用。

对外源性RNA酶主要通过以下几个途径污染RNA制品：

①玻璃制品、塑料制品和电泳槽；

②研究人员造成的污染；

③污染的溶液。

因此在实验中必须采取下列措施抑制外源性RNA酶：

①实验室用的普通玻璃制品和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15min。RNA电泳槽需用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min，然后用0.1%DEPC水彻底冲洗电泳槽。灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不需要处理；

②在RNA提取过程中,应戴一次性手套,对接触可能污染的器皿时，应勤换手套；

③配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC水在37℃处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。对不能高压灭菌的试剂，用经DEPC水配制处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22μm滤膜过滤除菌。

真核细胞总RNA 制备方法有多种，包括异硫氰酸胍—氯化铯超速离心法、盐酸胍—有机溶剂法、氯化锂—尿素法以及热酚法、异硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法以及TRIzol试剂提取法等。目前实验室提取总RNA的常用方法为异硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol试剂提取法。异硫氰酸胍法制备真核细胞总RNA，是将已知最强的RNase酶抑制剂异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了核蛋白复合物的解离，使RNA和蛋白质分离并进入溶液，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩。

二． 材料与方法

1 材料

实验鱼，购于市场。

2 仪器、用具

台式离心机、恒温水浴锅（70℃）、分析天平、移液器、一次性注射器、方盘、镊子、手术剪、培养皿、1.5ml离心管。

3试剂

95%的RNase-free乙醇；0.1%DEPC处理水；SV RNA Lysis Buffer；SV RNA dilution Buffer；SV RNA Wash Solution；Yellow core Buffer；MnCl ^₂  ；0.09M；DNase Ⅰ；SV DNase Stop Solution；Nuclease-Free water。

4 方法

1） 材料的准备

(1) 将培养皿、剪刀、眼科镊灭菌，-20℃预冷。

(2) 用泡沫盒盛装碎冰，将培养皿置于冰上，将剪刀、镊子置于培养皿中。

(3) 用桶盛装碎冰，加入少量的自来水，用纱布包裹鱼放入桶中。

(4) 将已麻痹的鱼置于方盘中，用剪于肛门向前及斜向上将腹腔剪开，取出内脏，分离肝脏置于培养皿中。

(5) 取1.5ml的离心管于分析天平上，调零。

(6) 用镊子取20-30mg的肝脏组织于1.5ml的离心管中，称重。

2） 实验操作

(1) 取约30mg组织于1.5ml 离心管中，加入175μl SV RNA Lysis Buffer，用一次性注射器将组织压碎、反复抽打混匀。

(2) 加350μl SV RNA Dilution Buffer（蓝色），翻转管子3-4 次混匀，置70℃水浴3min。

(3) 冰上冷却1-2秒，14000rpm离心10min，上清液移入一新离心管。

(4) 加入200μl 95%的乙醇，枪头混匀。

(5) 将上述混合液移入Spin Basket Assembly，14000rpm离心1min，弃滤液。

(6) 加入600μl SV RNA Wash Solution（with ethand added），14000rpm离心1min，弃滤液。

(7) 在一新离心管中配制DNase incubation mix：

Yellow Core Buffer    40μl

MnCl₂ 0.09M     5μl

DNase Ⅰ     5μl

(8) 将上述50μl混合液直接加在Spin Basket的膜上，室温（20-25℃）保育15min。

(9) 加200μl SV DNase Stop Solution（with ethand added）至Spin Basket 14000rpm，离心1min。

(10) 加600μl SV RNA Wash Solution，14000rpm离心1min，弃滤液。

Yellow core Buffer 40μl    MnCl2，0.09M 5μl   DNase I 5μl

(11) 加250μl SV RNA Wash Solution，14000rpm离心2min，将Spin Basket转移到一新离心管中。

(12) 加50μl Nuclease-Free Water 至膜上，14000rpm离心1min，溶解RNA，-20℃保存。

(13) 取5μl RNA样品，1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。