总RNA的提取和纯化的操作规程

完整RNA 的提取和纯化，是进行RNA 方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA 分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）：样品细胞或组织的有效破碎；２），有效地使核蛋白复合体变性；３），对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径，1)，提取总核酸，再用氯化锂将RNA 沉淀出来；2)，直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA 的丢失，目前该方法的使用频率已很低。

方法一:总RNA 的试剂盒快速提取

一些公司推出的总RNA 提取试剂盒，可以用来制备高质量的可用于建库的RNA 。该总RNA 纯化系统采用两种著名的RNA 酶抑制剂，异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇，加上整个操作都在冰浴下进行，这样就能显著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

一：仪器

恒温水浴，冷冻高速离心机，紫外分光光度计，取液器，电泳仪，电泳槽。

二：试剂

RNA 提取试剂盒，0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC)，75%乙醇

操作步骤

(一):细胞或组织破碎

A:微生物材料

１：发酵３－４天(或对数生长期)的菌体，离心收集菌丝体(动植物材料无需此步处理)

２：用经DEPC处理的水洗菌丝体２－３次，并尽量除去残存的水

３：加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA

４：研磨后的样品转移至１２ml变性液的容器中匀浆。

B:动植物细胞培养材料 (适用的样品量为细胞:108)

1:细胞或组织培养:按常规方法进行

2:深层悬浮培养细胞的破碎:

(1)细胞收集:含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3000g离心5分钟

(2)细胞洗涤:上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3000g离心5分钟，

(3)细胞破碎:在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆

3:表面培养细胞的破碎:

(1)确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108

(2)细胞收集:将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8毫升预冷变性液，转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。

(3)用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推，直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。

(4)将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中，匀浆破碎细胞。

C:植物组织破碎 (适用的样品量为0.05g组织)

(1)将600ul变性液置于1.5ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。

(2)将0.05g新鲜组织用液氮冰冻

(3)在液氮下，研磨组织块

(4)待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。

D:动物组织破碎 (适用的样品量为1克组织)

(1)将12毫升变性液置于50毫升离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。

(2)在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。

注1:研磨组织块用于RNA 提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。

2:变性液及相应的离心管需预冷。

(二):RNA 的抽提

在经变性液匀浆的细胞或组织600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。

600ul酚\氯仿\异戊醇(25\24\1)，彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。

冰裕中10-15分钟，离心，4℃，10000g，20分钟。

上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA。

离心4℃，10000g，20分钟。

沉淀RNA ，冷冻干燥15分钟 ， RNA 沉淀重新溶于300ul变性液中，可振荡(有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短)。

60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。

600ul酚\氯仿\异戊醇(25\24\1)，彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。

冰裕中10-15分钟，离心，4℃，10000g，20分钟。

上层水相吸至无菌离心管中。

等体积异丙醇二次沉淀(-70℃，30分钟)，７５％乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥，复溶于去RNA 酶的水中(对于准备长期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M，再加入2.5体积的乙醇，－７０℃保存。)

注：1变性液组成：25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mM β-巯基乙醇)，65℃溶解，过滤灭菌，4℃预冷。

2酸性酚配制：55℃时，500g酚溶入500ml50mM，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500ml50mM，pH4.0乙酸钠，直到pH<4.1。

方法二: 氯化锂法提取总RNA

本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA 酶，用氯化锂选择沉淀RNA ，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA ，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高，小RNA 片断丢失的缺陷。

仪器： 同上

试剂：

氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】

悬浮液【10mM  Tris-HCL (pH7.6) ，1mM  EDTA (pH8，0) ，0.5%SDS】

其余同上

操作步骤：

1：对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中

2：匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟

3：取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2

4：沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟

5：取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。

6：70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

7：RNA 溶解液溶解沉淀，得RNA ，分装，于－70℃保存。