葡萄糖在小鼠克隆胚胎发育中的作用

实验步骤

1. 克隆胚胎制备和胚胎培养

卵母细胞在含有5.5mM葡萄糖的CZB培养液中培养。用含有5.5mM葡萄糖和2.5ug/ml 细胞松弛素B的HEPES-CZB液(HCZB)作为工作液，卵母细胞在此液中被去掉纺锤体-染色体复合体；用卵丘细胞作为核供体。用注射针反复吸入、吹出卵丘细胞，以除去其细胞膜和大部分细胞质，然后用注射针将裸卵的核注入去除纺锤体-染色体复合体的卵母细胞中。

孤雌胚胎所用的卵母细胞与用于制备核移植胚胎的卵母细胞来源相同。

孤雌胚胎和核移植胚胎用不含Ca² 、却含10mM Sr² 和细胞松弛素B的CZB培养液进行激活。所有步骤中都不使用二甲基亚砜，以避免其对克隆胚胎造成的不受控制的影响。单细胞正常受精胚胎是通过超排的(B6D2)F1雌鼠和(B6D2)F1雄鼠交配获得的。

所有胚胎用Whitten 培养液(MW)培养。之所以选择此培养液是因为利用(B6D2)F1小鼠卵母细胞制备的受精胚胎、孤雌胚胎和核移植胚胎在此种培养液中更利于它们除了二细胞期之外的胚胎发育。对正常胚胎发育有更好的促进作用的其他培养液，对克隆胚胎却有阻滞作用，所以不被采用。

2. 分析葡萄糖代谢

胚胎在WM中过培养，到单细胞后期或二细胞中期时用来进行葡萄糖代谢分析。我们利用[1-14C]葡萄糖、[6-14C]葡萄糖、[5-3H]葡萄糖，来分析葡萄糖代谢情况。使用[1-14C]葡萄糖时，14 CO₂ 经过戊糖磷酸途径或三羧酸循环释放。使用[6-14C]葡萄糖时，14 CO₂仅通过三羧酸循环释放。使用[5-3H]葡萄糖时，3 H₂O 仅通过糖酵解途径释放。14CO₂和3H₂O用一种装置收集然后通过一种方法进行量化。通过比较三种不同位置同位素标记的葡萄糖的代谢率，可以确定不同途径的代谢率。为了准备用于测量代谢的培养液，我们在真空条件下冷冻适量的[1-14C]葡萄糖、[6-14C]葡萄糖、[5-3H]葡萄糖，然后用不含葡萄糖的HCZB进行溶解。用冷的非放射性葡萄糖将溶液中葡萄糖的含量增加至4mM。

根据放射性物质的放射性强弱，将5-20枚胚胎放到1ml注射器的空心活塞中。注射针管中放有600ul 0.1M 的NaOH，用来捕获胚胎释放出的14 CO₂ 和3 H₂O 。将装有胚胎的活塞推入注射器，盖上针帽。此简易装置与Eppendorf悬滴系统相比，两者在敏感度和检测准确度上并没有差异，但是我们发现前者在将检测物质放入注射器时，不会发生很大的倾斜，并且放入物质能够很快的有效聚集在一起。经过37°C、3h的孵育后，小心的将NaOH捕获液转移到发光瓶中，1h后，确定代谢物种辐射量的多少。每次试验，都要有四个空白对照(不放胚胎)，但含有5ul HCZB，在同样的条件下进行孵育，用以说明葡萄糖降解的原因，也用于进行下一步的计算。

计算出葡萄糖降解的效率，并用每枚胚胎每小时降解多少皮摩尔表示出来。每次试验至少重复三次，每次试验所用胚胎数为3-6枚。

3. 酶和代谢分析

用冷冻干燥法处理胚胎，然后用来进行酶和代谢分析。每枚胚胎在油下进行萃取，并用来进行酶循环分析。计算每个胚胎中各自的ATP含量。相似的，计算每个胚胎内部的糖原水平。腺苷酸酶和糖原合酶的分析在前边已经介绍了。所有代谢的计算，都用每千克湿重含有多少mmole物质表示(每枚胚胎重160ng或160pl)。每次试验至少重复三次，每种胚胎zui后分析数量必须达到10-20枚。

4. 线粒体拷贝数量

利用荧光定量PCR，检测线粒体DNA(mtDNA)与核DNA(nDNA)的比率，从而间接测定mtDNA的含量。所用的mtDNA引物：5-CAGGATGAGCCTCAAACTCC-3(上引物)和5-GGTCAGGCTGGCAGAAGTAA-3(下引物) 。所用的nDNA引物(18S核糖体RNA)：5-TCGAGGCCCTGTAATTGGAA-3(上引物)和5-CCCTCCAATGGATCCTCGTT-3(下引物)。每枚单个胚胎放入0.2ml PCR管中，其中含有1ul 17uM SDS和 2ul 125ug/ml 蛋白酶K，37°C孵育过，然后95°C 15min 用以使蛋白酶失活。

5. 线粒体的超微结构

从每个处理组取五枚胚胎，用2%多聚甲醛和0.6%戊二醛的混合物固定，然后用含有1%的二甲基胂酸钠进行后固定，再用一系列浓度逐步升高的乙醇对其进行脱水处理，然后用PolyBed 812 树脂包埋。用切片机制备超薄切片，将切片放到铜网上，用醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，然后放到Ieol 1200 EX 显微镜下进行观察。至少每个处理组的三枚胚胎用来进行主观上的线粒体形态学上的评定，并用好、中、差来表示。

6. MitoTracker 染色和分析

为了能够看到有活性的线粒体，胚胎在含有葡萄糖的WM液(WM-)中或不含葡萄糖的WM液(WM )中孵育30min，上述两液均含有500nM 氯甲基-四甲基-rosamine(MitoTracker，分子探针)。MitoTracker是对活性线粒体特异的荧光探针。样本经上述处理后，在培养液中洗60min，然后用4%多聚甲醛固定30min。此染色法是可见的，胚胎显微镜(Eclipse 800; Nikon Instruments,Melville, NY)拍照。上述显微镜配备有表面荧光和不同干涉相差光学系统。显微镜放大倍数为 X60，聚焦于每枚胚胎zui长的直径上；用Cool Snap 相机和 MetaMorph 7.1.0.0 软件系统取相。线粒体形态学分析用MetaMorph中的形态学分析工具进行分析。手动记录每枚胚胎的周长(每个胚胎阶段，每个处理组都要分析五枚胚胎)，记录周长的相关像素强度值都会被软件记录，将这些值录入Microsoft Excel以计算每个阶段、每个处理组的平均值。