一种快速有效的基因分型斑马鱼的方法（二）

Fig.1. 应用HRMA对p53zy7（p53I166T）和apchu745（apcmcr）进行点突变基因分型。A：p53I166T 错译突变周围的序列。有下划线的为引物序列，星号标注的是SNP位点。野生型产物的Tm值为79.5℃，突变型为80.9℃。B：Melting curves of the PCR products from 48 tail-clip genomic DNA samples isolated from the adult progeny from a cross of p53zy7/þ heterozygotes. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.C：apchu745错译突变周围的DNA序列，下划线标注的是引物序列，星型标注的是SNP位点。野生型产物的Tm值是80.9℃，突变的为82.0℃。D：Melting curves of the PCR products from 48 embryonic DNA samples generated by crossing a apchu745/t fish to apchu745/t fish. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue
curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.

      p53基因型（12野生型：24杂合子：12突变型）和APC基因型（11野生型：25杂合子：12突变型）符合孟德尔的1:2:1的比率。此外，通过对p53的24个样品以及APC的24个样品进行测序，也验证了HRMA的结果的准确性是100%。

缺失检测
    除了SNP的检测，我们还想评估是否HRMA可以提供斑马鱼小缺失的基因分型。斑马鱼突变体的bap28的第2外显子有5个碱基对的缺失（Azuma et al.,2006）。在缺失的侧翼设计引物，结果产生46bp的野生型产物和41bp的突变产物，二者的Tm值有1.6℃的差异（表2A）。分析48个DNA样品，每一个代表一个杂合—杂合的胚胎，产生了三种不同的溶解曲线（表2B）。在这个分析中，较少的纯合突变产物的Tm值较低，杂合子表现出中间的Tm值产物和异源双链的产物。和p53以及APC的基因分型相似，BAP28的基因型（12野生型：25杂合子：11纯合突变）的比符合孟德尔的1:2:1的遗传比率，而且24个不同的基因型都通过测序进行了验证。

Fig.2. 通过溶解曲线进行bap28突变小的缺失的基因分型。A：bap28缺失突变周围的DNA序列。下划线标注的是引物序列，虚线标注的是缺失。野生型产物的Tm值是76.8℃，突变型为75.2℃。B：从bap28y75/+杂合子得到的48个晶胚的PCR产物的溶解曲线。聚类后，红色曲线表示野生型样本，蓝色曲线表示突变型样本，黑色为杂合样本。

转录病毒插入检测
       斑马鱼的插入诱变是一种常见的也是一种有效的研究基因打断的方法（Golling et al., 2002; Balciunas and Ekker,2005）。我们想设计一种方法验证HRMA是否可以用于斑马鱼的特异性插入的基因分型。该突变系hi821a（Amsterdam et al., 2004）在wdr43基因的第二内含子有一个逆转录病毒的插入（表3A）。设计引物产生一个小的产物，用Tm值来区分野生型和突变的等位基因（表3B）。分析插入突变的引物设计比点突变的引物设计更加灵活；目的是设计的PCR产物有更大的Tm的差异。理想情况下，临近插入位点的引物都可以用于PCR产物，尽量减小两个产物的同源序列。对于hi821a等位基因，正向引物（插入位点在基因内区2,50）包括突变和野生型等位基因。引物只针对野生型和插入突变设计，因此，产物有不同的大小和不同的溶解温度。对于hi821a位点，野生型等位基因内含子2的反向引物，在插入位点30，插入突变的反向引物接近逆转录病毒LTR的50末端（表3A）。因此，纯合野生型或突变都只有一个产物和一个Tm值（表3C）。虽然引物A和B或A和C2在理论上都能扩增得到突变等位基因的产物，大片段的产物（7+ KB）随着延伸时间的缩短（4sec），选择性的扩增各产物。此外，在这种情况下，较大的产物可能被扩增，这一产物的Tm值可能会高并且易于在分析中排除。在杂合子中多有的产物都被扩增。这些产物有截然不同的溶解温度，三种不同的基因型很容易检测到（表3C）。值得注意的是，在分析插入突变时一个重要的步骤是PCR反应的最后一步没有加热到95℃，而且加了一步72℃的延伸以确保只形成同源双链。Wdr43的基因分型（12野生型：24杂合子：12突变型）遵循孟德尔定律。所有24个基因型都通过PCR引物扩增野生型等位基因（583bp）和突变等位基因（230bp），然后进行琼脂糖凝胶电泳检测来验证。