DNA测序技术的现状和发展（五）

1.3 AB SOLiD测序仪

AB SOLiD测序仪可以对由任何方法制成的DNA文库进行测序。AB SOLiD测序仪有一个极大的特点就是能够将富集模板片段的微珠在芯片上进行高度可控的任意排列。AB SOLiD测序仪也是使用如图5a中所示的微乳液PCR方法扩增模板片段的，不过，它这里使用的是直径只有1μm的小磁珠。PCR扩增反应结束之后，微乳液滴被打破，小磁珠被富集起来固定到固态平板上，制成高密度测序芯片。后面的合成测序法由DNA连接酶而非DNA聚合酶完成。

首先，通用引物与模板片段两端的接头序列互补结合，然后连接酶将一个被荧光标记的8bp长的核酸探针片段（fluorescently labeled octamers）连接到引物末端（图6c）。这段8bp长的核酸探针片段是经过设计的，比如其中第五位碱基上就标记了荧光。连接反应完成之后，就可以采 集荧光图像，然后在第五位碱基和第六位碱基之间切断，去掉荧光标签。如此反复，就可以获得每间隔四个碱基的第五号碱基的确切信息，比如第5号碱基、第10 号碱基、第15号碱基以及第20号碱基等等。经过几轮这样的循环之后，已经获得延伸的引物会变性脱落，再重新结合上新的引物从头开始新一轮测序，不过这一 次可能获得的是第4号碱基、第9号碱基、第14号碱基以及第19号碱基的信息。我们可以使用不同长度的引物（+1或者-1）或者使用在不同位点（比如第2 号碱基）标记荧光的8bp核酸探针片段达到这个目的。如此反复，最终就能获得整条模板片段的完整序列信息。

AB SOLiD测序仪还有一个特点就是使用了双碱基编码技术（two-base encoding），该技术具有误差校正功能，因为它是通过两个碱基来对应一个荧光信号而不是传统的一个碱基对应一个荧光信号，这样每一个位点都会被检测两次，因此出错率明显降低。

Polonator测序仪是一个和AB SOLiD测序仪比较相似的产品，因为它也运用了J.S等人和哈佛大学Church研究小组开发的部分系统。Polonator测序仪同样也使用微乳液 PCR法扩增模板片段，使用连接酶法测序。不过，Polonator测序仪的价格要比其它第二代测序仪低得多。而且更重要的是，Polonator测序仪 是一个开源的设备，用户可以通过自己编程“设计”出最适合自己的测序仪。不过，Polonator测序仪目前可测序的长度还非常有限。

值得注意的是，454测序仪、SOLiD测序仪以及Polonator测序仪还都存在一个共同的不足，那就是微乳液PCR技术实在是太过麻烦并且对 实验操作的技术要求较高。不过从另一方面来说，使用仅仅只有1μm大小的磁珠构成的高密度测序芯片进行测序（不论是使用聚合酶法、连接酶法，还是其它的生 化方法）是最有可能实现的高通量测序方法。因为1μm是衍射技术（diffraction）所能分辨的极限大小了。另一方面，最近报道的使用1μm磁珠进行高分辨率芯片点样技术的突破，使我们有望实现每个测序模板一个像素（one pixel per sequencing feature）的愿望。

1.4    HeliScope测序仪

HeliScope测序仪是由Quake团队设计开发的，它实际上也是一种循环芯片测序设备。不过，HeliScope测序仪最大的特点是无需对测序模板进行扩增，它使用了一种高灵敏度的荧光探测仪直接对单链DNA模板进行合成法测序。首先，将基因组DNA切割成随机的小片段DNA分子，并且在每个 片段末端加上poly-A尾。然后通过poly-A尾和固定在芯片上的poly-T杂交，将待测模板固定到芯片上，制成测序芯片。最后借助聚合酶将荧光标 记的单核苷酸掺入到引物上（图6d）。采集荧光信号，切除荧光标记基团，进行下一轮测序反应，如此反复，最终获得完整的序列信息。根据最近的报道，经过数 百轮这种单碱基延伸可以获得25bp或更长的测序长度。HeliScope测序仪的其它特点见表6。

原文检索：Jonathan M Rothberg & John H Leamon. (2008) The development and impact of 454 sequencing. Nature Biotechnology, 26(10): 1117-1124.