脑损伤的组织学评估
在一些实验中，成像结果通过脑组织的组织学平估来确定。成像后，动物被灌注肝素化盐水和10%的福尔马林，然后使用Vibrotome切片，切成25µm厚的断片。邻近的部分都使用苏木精和曙红进行组织化学染色，来鉴定受损区域，或者使用异硫氰酸荧光素（FITC）（1:100；30min）鉴别脑血管，以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）(1
mg/mL; 1 min)进行细胞核染色。H&E-染色的部分使用LCM PixCell
IIe显微镜观察并记录相位对比。血脑屏障使用Axiovert 200荧光显微镜(Carl Zeiss, Maple Grove,
MN)肉眼观察cy5.5从大脑薄壁组织溢出，使用近红外模式（660到680nm激发滤光片和一个700nm的纵向发射滤光片）。成像过程使用AxioVision
LE Rel 4.4软件。
统计分析
数据显示为±SD荧光强度或荧光的浓度。缺血性和对侧的ROI的统计分析的差异使用单向方差分析，随后通过多样本重复比较或双尾配对样本t检验说明。p值小于0.05被认为差异显著。
结果
短暂的MCAO后Cy5.5体内成像对比度增强
近红外染料Cy5.5不会穿过完整的血脑屏障体外(数据未显示)或体内(通过实验证实，见图6B)。在循环中染料迅速消除，主要是通过肾脏排泄。已知过渡态的MCAO可以产生BBB，小分子的钆和大分子的白蛋白，分别使用Cy5.5和BSA-Cy5.5为光学标记物，基于示踪组织溢出来定位局部缺血性中风。类似的原理应用于核磁共振成像技术，使用钆增强成像效果。在最初的一系列实验中，60分钟MCAO后，紧接着进行24小时再灌注，因为它会产生可再生的梗塞，影响很大一部分侧纹状体和颅侧区皮层，也会缓和血脑屏障的大分子中断。实验方法见图1A。经过最后的60分钟的MCAO测量所有动物的重新缺血性值，结果统一的减少局部脑血流量产国缺血性区域低于20%。之后重复缺血值rCBF迅速恢复为大约70%，而且在重复灌注时可以保持这个值大约一小时以上（数据位显示）。rCBF值测量值证明实验组的最小变异值（数据未显示）和已报道的同样的缺血性模式的数据相似。成像前Cy5.5静脉内注射15分钟，随后在半球形的ROIs获得两个成像参数FI和Conc并进行分析（图1
B-D）。FI信号变现出明显的大脑左侧（缺血性）偏侧性（见图1B）；在六个单独的动物的大脑半球缺血的FI平均值为3,580 ± 50
AU，对侧半球为730 ± 35 AU（(p < .01; t-test; each ROI =150
points)；右大脑半球FI值与重新缺血的基线水平相似 (700±25 AU)，在注入Cy5.5的模拟动物中的测量值为 (740±30
AU)。这一结论证实大部分Cy5.5在注入15分钟后在循环中消失。
与其他成像技术不同，时域光学技术可以给出荧光基团的深度和浓度信息，可以进行3D重建和断层成像。三维影像图分别显示有x轴，y轴好z轴的头部位置（见图1C），1毫米厚度的光切面见图1D，在缺血新半球深度为6到9毫米（从大脑侧面顶部测量）时Cy5.5的浓度值最大（图1D）。8-9毫米的光学切片（图1D放大图像）缺血性区域三维扫描点的Cy5.5的浓度测量值要比对侧的高10倍。
图1：动物经过短暂的60分钟MCAO，紧接着进行24小时再灌注并注入Cy5.5（100nmol，成像前15分钟）的头部ROI区域的体内成像图。使用eXplore Optix时域临床前成像仪。A：本实验试验方法图。B：缺血/再灌注前后（I/R）头部ROI荧光强度（FI）的代表图像。C：头部浓度体积测定面重建（分三部分显示，X轴、Y轴和Z轴），在动物头部侧面有3D断层成像。D：Z轴部分（201mm切片）通过头部厚度。头部顶端侧面8—9毫米深度部分的信号最强。是6个动物最具代表性的实验结果。
Cy5.5溢出的组织学确认
梗塞形成的范围由60分钟MCAO及随后的24小时在灌注在TTC染色脑切片厚度的评价。通过H&E染色进行神经元损害的组织学确认，使用Farber和他的同事们研究的标准，Cy5.5溢出通过荧光显微法评价。在荧光显微镜下大脑部分大致相当于脑区在厚脑切片中描述。如图2B显示，缺血性半球的切片相当于图2A中1,2,3的厚度，表明有典型的神经元坏死，而部分对应厚片4(见图2)出现了类似的侧大脑半球。
邻近部位的复染剂使用导管结合凝集素（绿色）（图2C），cy5.5（红色信号）溢出到大脑薄壁组织扩大到缺血性区域相当于厚片1到3，但是与厚片4不同（图2，A和C）。有趣的是，一些Cy5.5薄壁组织外溢始终观察到对侧半球的切片相当于厚片1（图2C1，白色箭头），甚至在没有组织学证据的神经损伤。血管内残留的Cy5.5荧光，主要在缺血性部位观测到，可能是由于不良的缺血性血管的灌注。
图2：A，经过60分钟大脑中动脉闭塞（MCAO）后24小时大脑切面TTC染色的代表性图像。缺血和脑切片（1-4）对侧25mm部分的组织学（B）和荧光显微镜（C）分析结果，过程见材料和方法部分。使用FITC-番茄血凝素（绿色）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（蓝色）使大脑血管形象化。Cy5.5溢出的信号（红色）在对侧采用箭头显示。比例尺=10µm。是6个动物最具代表性的实验结果。